吳振起 ，馬 融，岳志軍， 魏 巍

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)是各年齡段兒童急性上、下呼吸道感染的常見病原，其年感染發(fā)病率為9.6%～66.7%，每隔3～8 a流行一次，并可在密閉環(huán)境如學(xué)校、幼托機構(gòu)、夏令營等暴發(fā)[1-2]。隨著大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的日益嚴峻，難治性MP肺炎病例有逐年增加的趨勢[3]。MP感染嚴重影響兒童的身體健康，已引起國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注。開展MP相關(guān)基礎(chǔ)研究迫在眉睫，而MP的培養(yǎng)和菌力判定是限制MP研究的瓶頸問題之一。MP菌力及濃度的判定往往借助于顏色改變單位(colour change unite，CCU)的測定。已測定CCU的MP經(jīng)過凍存-復(fù)蘇-培養(yǎng)-傳代-培養(yǎng)……，其CCU往往發(fā)生了變化。為驗證能否在MP培養(yǎng)的過程中，通過倒置顯微鏡下觀察MP的濃度和分布，估算其CCU，本研究通過鏡下觀察MP培養(yǎng)濃度和分布范圍，確定其分級，并與測定的CCU和實時熒光定量PCR(FQ PCR)測定結(jié)果進行關(guān)聯(lián)，并進行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MP標準株FH由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病毒室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基主要成分為PPLO培養(yǎng)基、無菌胎牛血清、新鮮酵母浸液、葡萄糖、青霉素和酚紅等(調(diào)整pH值為7.6左右)。

1.1.3 實驗材料 FQ PCR 試劑盒(中山大學(xué)達安基因股份有限公司),內(nèi)參是GAPDH(三磷酸甘油醛脫氫酶)，H1: 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3′，H2: 5′-TGGAAATTGTGAGGGAGATGC-3′，擴增特異片段長度為336 bp，胎牛血清(Hyclone)。

1.1.4 儀器設(shè)備 倒置熒光顯微鏡(Leica LEZTDML)，低溫高速離心機(德國BIOFUGE28RS)，實時熒光定量PCR儀(羅氏LCⅡ)，超低溫冰箱(日本MDF-382E)。

1.2 方法

1.2.1 MP菌株培養(yǎng)及菌落測定 將凍存的MP接種至液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃,含5% CO2、飽和氮的厭氧培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)液顏色由紅變黃時進行連續(xù)傳代，取第3代。以培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時的最高稀釋度作為CCU，采用CCU/mL方法測定MP濃度，取菌液濃度1×106CCU/mL備用。

1.2.2 倒置熒光顯微鏡觀察 采用倒置顯微鏡(10×20倍)觀察細胞瓶中的MP，同樣條件下觀察10個視野，取均值。自擬MP培養(yǎng)分級標準：成簇MP占視野≥50%，或單個MP占視野≥75%為“++++”；成簇MP占視野20%～50%，或單個MP占視野50%～75%，為“+++”；成簇MP占視野≤20%，或單個MP占視野30%～50%，為“++”；單個MP占視野≤30%，為“+”；沒有MP，為“-”。其中“++++”“+++”“++”“+”培養(yǎng)基均發(fā)生顏色改變，即由紅色變?yōu)辄S色，“-” 培養(yǎng)基無變化。

1.2.3 實驗方法 取不同凍存時間的MP菌液，分為A、B、C、D四組，利用10倍稀釋法將待測菌液以培養(yǎng)基稀釋成1×10-1～1×10-6等一系列濃度，共24組。每天觀察培養(yǎng)基的顏色變化，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。采用目測法測定各組的CCU。采用FQ PCR檢測MP。取菌液0.2 mL，加入4倍體積生理鹽水，吸取至1.5 mL滅菌離心管，12 000 r/min離心5 min，去上清液。沉淀物中加試劑盒所配DNA提取液50 μL，振蕩混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL，加入DNA擴增反應(yīng)管中，5 000 r/min離心10 s，上機進行DNA擴增。結(jié)果判斷由儀器自動給出。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，使用等級相關(guān)分析方法Kendall法及Spearman法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 倒置顯微鏡下MP觀察結(jié)果與CCU、FQ PCR檢測結(jié)果

倒置顯微鏡(20×10倍)觀察細胞瓶中的MP生長情況，在培養(yǎng)的第10天，所有細胞瓶的培養(yǎng)基均發(fā)生顏色改變，其中“++++”8 瓶，“+++”～“++++”1瓶，“+++”5 瓶，“++” 5瓶，“+”5 瓶，“-” 0瓶。見表1、2和圖1。

圖1 MP FQ PCR檢測結(jié)果Fig.1 The test result of FQ PCR for MP

樣本稀釋倍數(shù)鏡下觀察結(jié)果CCU測定值FQPCR測定值A(chǔ)101+10-12.696E+10102++10-22.362E+11103++10-37.785E+10104+++10-51.750E+11105+10-22.084E+10106++10-25.794E+10B101+++10-41.800E+11102++10-23.598E+10103++++10-52.827E+11104++++10-61.995E+11105++++10-52.928E+11106+++10-56.932E+10C101+10-13.172E+10102++10-27.276E+10103++++10-72.622E+11104++++10-67.918E+11105++++10-63.269E+11106++++10-51.348E+11D101+10-14.884E+10102++++10-22.961E+11103+++～++++10-52.429E+11104+++10-42.269E+11105+++10-52.473E+11106+10-22.318E+10

表2 MP倒置顯微鏡分級結(jié)果對應(yīng)FQ PCR檢測結(jié)果Table 2 The grading results under MP inverted microscope and corresponding results to FQ PCR(±s)

2.2 MP倒置顯微鏡分級結(jié)果與FQ PCR結(jié)果相關(guān)性分析

通過等級相關(guān)分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall相關(guān)系數(shù)為0.738，P值為0.000，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.858，P值為0.000，證明與FQ PCR值顯著相關(guān)，呈正比直線相關(guān)關(guān)系。從散點趨勢圖也可看出散點存在顯著的直線趨勢。見圖2、3。

圖2 MP倒置顯微鏡下觀察結(jié)果與FQ PCR值散點趨勢圖Fig.2 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the scatter plot of FQ PCR

圖3 MP倒置顯微鏡下觀察結(jié)果與FQ PCR值Fig.3 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the value of FQ PCR

通過直線回歸方差分析，F(xiàn)=19.851，P=0.000，可認為y與x之間有線性回歸關(guān)系。直線回歸方程的截距a=-8E+10,檢驗統(tǒng)計量為t=-1.294，P=0.209；回歸系數(shù)b=1E+11，檢驗統(tǒng)計量為t=4.455,P=0.000,因此回歸方程為y=1E+11x。

2.3 鏡下觀察結(jié)果與CCU測定值的冪指數(shù)相關(guān)性分析

通過等級相關(guān)分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall相關(guān)系數(shù)為-0.788，P值為0.000，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.847，P值為0.000，證明倒置顯微鏡觀察分級結(jié)果與CCU測定值的冪指數(shù)(10的N次冪中的N)的絕對值顯著相關(guān)，呈正比直線相關(guān)關(guān)系。從散點趨勢圖，也可看出散點存在顯著的直線趨勢。見圖4。

圖4 MP倒置顯微鏡下觀察結(jié)果與FQ PCR值散點趨勢圖Fig.4 The Microscope Observation of Mycoplasma pneumoniae culture and the scatter plot of FQ PCR

2.4 MP稀釋倍數(shù)與FQ PCR結(jié)果相關(guān)性分析

通過等級相關(guān)分析(Kendall法和Spearman法)，Kendall的tau_b相關(guān)系數(shù)為0.078，P值為0.614，Spearman的rho相關(guān)系數(shù)為0.074，P值為0.731，說明菌液的稀釋倍數(shù)(10的N次冪)與FQ PCR值無相關(guān)。觀察菌液稀釋倍數(shù)與FQ PCR值曲線圖，提示曲線并無顯著規(guī)律，且每個樣本的曲線不同；10-4稀釋倍數(shù)時，4組FQ PCR值均較理想。見圖5。

圖5 各組MP稀釋倍數(shù)與FQ PCR值曲線圖Fig.5 The MP dilution factor and the FQ PCR value curve of each group

3 討 論

由于支原體基因組小，生物合成能力有限，需由其寄生的宿主提供多種營養(yǎng)物質(zhì)才能生長繁殖，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分復(fù)雜。MP繁殖緩慢，1～6 h分裂一代，反復(fù)傳代后生長加快。MP代謝產(chǎn)酸，酚紅指示劑可以變色。CCU是培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時的最高稀釋度，則菌液濃度以CCU/mL計算。而MP測定CCU往往要經(jīng)過10～14 d的培養(yǎng)，周期比較長。MP液體培養(yǎng)物在倒置顯微鏡下為球形或長絲狀，以滑行方式運動[4]。實驗室往往聯(lián)合采用血清學(xué)、PCR或培養(yǎng)三種方法，以提高MP感染診斷的準確性[5]。由于MP培養(yǎng)困難，生長緩慢、分離率低，檢測核酸和特異抗體是臨床病原學(xué)檢測的常用方法[6]。MP培養(yǎng)陽性率較低，臨床診斷多用血清抗體滴度測定,而患者感染的病程、機體免疫狀態(tài)及檢測方法直接影響抗體檢測的陽性率[7]。國內(nèi)MP抗體檢測靈敏度和特異度較差，致使臨床對于MP感染檢測能力有限[8]。而PCR擴增特異性基因片斷檢測，極大提高了MP診斷率,不同類型PCR檢測MP核酸的研究在臨床檢測中已廣泛應(yīng)用。本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)，同時提取凍存不同時間的液體培養(yǎng)基中的MP菌液，使MP菌液模板處于同等的反應(yīng)環(huán)境，避免了模板降解污染等情況發(fā)生。本研究采取了試劑公司上市的臨床應(yīng)用試劑盒，優(yōu)化了實驗反應(yīng)條件，Taq酶等因素引起的擴增效率問題。實時熒光定量PCR技術(shù)擁有特異性強、靈敏度高、定量準確、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[9-10]。該技術(shù)目前已成為分子生物學(xué)研究的重要工具，以其高靈敏度、高穩(wěn)定性，已作為病原體檢測的重要常用手段，將其作為MP病原體檢測對比方法。

本研究將鏡下觀察MP的濃度和分布范圍分為四級，即“++++”“+++”“++”“+”，測定CCU與FQ PCR，并與測定值進行關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)呈

正相關(guān)。鏡下觀察MP的分級越高，則測定的CCU與FQ PCR值就越高。因此在MP培養(yǎng)過程中，可通過MP鏡下觀察估算其CCU，較為簡便實用。通過分析菌液稀釋倍數(shù)與FQ PCR值曲線圖，發(fā)現(xiàn)菌液稀釋104倍數(shù)時，A、B、C、D四組FQ PCR測定值均較理想，可作為MP培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)稀釋倍數(shù)。本研究檢測的時間點是培養(yǎng)10 d，若每天都能在倒置顯微鏡下觀察MP生長情況，同時進行FQ PCR檢測，將有利于更加準確、動態(tài)地對MP鏡下觀察等級與CCU測定值進行關(guān)聯(lián)分析。

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