蔡 宏，王毅俠，李 鈾，劉 瑋，孫 平，董 寧

光動力學(xué)療法對瘢痕成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1的作用

蔡 宏1，王毅俠1，李 鈾1，劉 瑋1，孫 平1，董 寧2

(1.解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科 北京 100142; 2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷研究所 北京 100037 )

目的：探討光動力學(xué)療法（Photodynamic therapy, PDT）對體外培養(yǎng)瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibroblast，HSF）中轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響。方法：將原代培養(yǎng)的HSF分為對照組、HMME-PDT組、單純光敏劑組和單純激光照射組，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測PDT后HSF分泌至上清液的TGF-β1蛋白表達(dá)量，應(yīng)用Western-Blot觀察PDT對細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子β1的作用。結(jié)果：HSF分泌至細(xì)胞上清液的TGF-β1蛋白含量較高，而HMME-PDT后降低；HSF合成的TGF-β1蛋白水平高，HMME-PDT后HSF中的TGF-β1蛋白含量減少。結(jié)論：HMME-PDT能夠阻止TGF-β1的信號傳向細(xì)胞核，改變TGF-β1在HSF細(xì)胞水平的表達(dá)，使細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞增殖及膠原合成有關(guān)的靶基因得不到激活，從而抑制HSF增殖。

光動力學(xué)療法；激光；光敏劑；瘢痕成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1

血卟啉單甲醚（Hematoporphyrin Monomethyl Ether, HMME）－光動力學(xué)療法（Photodynamic therapy, PDT）可以抑制體外培養(yǎng)HSF的增殖，但是，對于該作用機(jī)制尚未闡明。HSF作為創(chuàng)傷修復(fù)過程中重要的功能細(xì)胞和HS組織中主要的細(xì)胞成分，其分泌的多種細(xì)胞因子對HS的形成和發(fā)展有著重要影響。

目前的研究表明，創(chuàng)傷愈合過程中，生長因子的持續(xù)刺激作用是導(dǎo)致HS形成的重要原因[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-beta, TGF-β）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、調(diào)控細(xì)胞的粘附和游走性等功能，它在創(chuàng)傷愈合過程中的效應(yīng)取決于自身特性、濃度、靶細(xì)胞的種類和特性等。在TGF-β超家族中，TGF-β1是與瘢痕過度形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子[2]。雖然TGF-β1對成纖維細(xì)胞的影響可能是正向的，也可能是負(fù)向的，但就總體而言，特別是從大量實驗研究和臨床實踐表明，TGF-β1是促進(jìn)HS發(fā)生的重要因子。本研究檢測了HSF在經(jīng)過HMME-PDT照射后TGF-β1蛋白的表達(dá)情況，并探討了其與HSF增殖的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗標(biāo)本來源：本實驗所有標(biāo)本均取自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形科的HS患者，取材經(jīng)患者本人同意，HS患者共10例，男8例，女2例，年齡15～25歲，病變部位為前胸、背部，均處于增生期，此前未接受過其它治療，均經(jīng)臨床及病理證實診斷。

1.1.2 實驗試劑和儀器：HMME（上海第二軍醫(yī)大學(xué)研制，批號031209）；人轉(zhuǎn)化生長因子定量酶聯(lián)檢測試劑盒（上海森雄科技公司）；TGFβ1單克隆抗體、FITC標(biāo)記羊抗鼠/兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；630nm半導(dǎo)體紅光激光器（桂林興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司）；LM－93II型激光功率計（中國計量院）；Olympus-BH2型生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)：將手術(shù)切除的瘢痕組織，在無菌條件下剪成0.5～1.0cm3的小塊，立即投入含100U/ml青、鏈霉素的培養(yǎng)液中。剪除脂肪、表皮及結(jié)締組織，D-Hanks液清洗至無油滴，反復(fù)剪碎至小于1mm3的小塊，按適當(dāng)間隔接種于培養(yǎng)瓶壁上，反轉(zhuǎn)使有組織塊的一面向上，加入含15%FBS的F12/DMEM培養(yǎng)基3ml，置37℃、5% CO2孵箱中孵育4h后，輕輕倒轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸沒組織塊，待培養(yǎng)液變黃后更換。4～10d組織塊周圍萌出細(xì)胞并逐漸形成細(xì)胞暈，20～30d細(xì)胞長滿瓶，形成細(xì)胞單層。

1.2.2 傳代培養(yǎng)：用0.25%胰酶消化，吹打，制成單細(xì)胞懸液。按1∶2比例傳代，建立HSF的傳代細(xì)胞系，實驗用第4～6代細(xì)胞，待細(xì)胞70%～80%融合時用于后續(xù)實驗。

1.2.3 PDT處理和實驗分組：培養(yǎng)的HSF與4μg/ml的HMME避光孵育4h后行PDT處理。照射波長為630nm，調(diào)整功率密度至10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2；照光前后均監(jiān)測輸出功率，輸出功率波動范圍＜±5%；PDT后繼續(xù)將細(xì)胞放回孵箱中孵育20h，再進(jìn)行下一步實驗檢測。其中，對照組不給予光敏劑和照光處理。并設(shè)立單純光敏劑組（PS：4μg/ml HMME）和單純激光照射組（Laser：波長630nm，功率密度10mW/cm2，能量密度2.5J/cm2）。

1.2.4 ELISA法檢測HSF分泌TGF-β1蛋白水平：檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒的敏感性小于16pg/ml。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線孔后，在待測品孔中加入已激活的標(biāo)本，每組每次4孔，重復(fù)3次。將反應(yīng)板置于37℃孵育120min，洗板后加入第一抗工作液，繼續(xù)37℃孵育60min。洗板后加入酶標(biāo)抗體工作液，37℃孵育60min，再次洗板并加入底物工作液，置37℃反應(yīng)5～10min后，加入終止液終止反應(yīng)，在酶聯(lián)儀上492nm處測定吸光值。根據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出TGF-β1蛋白含量，并依據(jù)最初稀釋比例計算TGF-β1蛋白濃度值。

1.2.5 蛋白的提取及Western-blot分析：應(yīng)用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，12 000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)管后于-80℃凍存。在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，上樣量為30μg總蛋白。電泳完畢后，使用電轉(zhuǎn)移儀將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉PBS液室溫封閉1h，在封閉液中分別加入兔抗人Smad3 mAb、磷酸化Smad3 mAb（1:1000）4℃過夜。TBST漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋比例為1:1000）。在暗室中，采用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，采用Chiss軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，行配對t檢驗，P＜0.05時差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1的影響：經(jīng)過5次重復(fù)實驗后，得出HSF對照組中細(xì)胞分泌至培養(yǎng)上清中的TGF-β1蛋白為（64.56±14.46）ng/ml，即表示HSF分泌至細(xì)胞外的TGF-β1蛋白含量較高。HMME-PDT治療組為（23.94±8.55）ng/ml，與對照組相比，其分泌量顯著降低，二者相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 HMME-PDT對瘢痕成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1的影響（n=12）

2.2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1的影響：與對照組相比，Western-blot結(jié)果表明HMME-PDT治療后HSF中TGF-β1蛋白含量減少（0.97±0.12 VS 0.28±0.02, P＜0.05），PS組和Laser組中TGF-β1蛋白表達(dá)無顯著改變（0.97±0.12 VS 0.82±0.14, P＞0.05；0.97±0.12 VS 0.86±0.17, P＞0.05）。

3 討論

HS是外傷、燒傷、感染或其它真皮損傷所導(dǎo)致的以膠原等大量結(jié)締組織基質(zhì)的過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病。大量研究表明[3]，TGF-β1表達(dá)增加與瘢痕的過度形成密切相關(guān)，當(dāng)TGF-β1失去調(diào)節(jié)，持續(xù)過表達(dá)就會導(dǎo)致皮膚及臟器的纖維化疾病，如硬皮病，肺纖維化以及HS，甚至瘢痕疙瘩等。

TGF-β1是迄今為止人們了解最多、與創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成以及多種纖維化疾病關(guān)系最密切的細(xì)胞因子之一，它還是成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞的有效趨化劑，是影響創(chuàng)面愈合及HS形成的最重要的生長因子。研究表明在裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射局部纖維化，而全身應(yīng)用可致機(jī)體主要臟器（如肺、肝、腎等）纖維化[4]。硬皮病、肺纖維化及HS等纖維化疾病患者可以檢測到病變部位TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，這可能是由于TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成ECM，抑制膠原酶和纖溶酶原激活物的表達(dá)，增加膠原酶抑制物—金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）、纖溶酶原激活物抑制劑（Plasminogen Activator Inhibitor 1, PAI-1）的產(chǎn)生，拮抗某些細(xì)胞因子的致絲裂作用等[5]。

圖2 HMME-PDT對HSF中TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)蛋白的影響

本實驗結(jié)果表明，HMME-PDT抑制體外培養(yǎng)的HSF合成并分泌TGF-β1蛋白。由于TGF-β超家族成員通過膜綁定異側(cè)的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體復(fù)合體傳遞信號，所以在配體綁定后，受體激活進(jìn)而導(dǎo)致胞質(zhì)Smad家族蛋白底物磷酸化[6]。TGF-β1誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以分為細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩相，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控也就體現(xiàn)在不同的水平之上。細(xì)胞外部分，包括配體的程序性激活和可控性擴(kuò)散、配體-受體復(fù)合物形成等；細(xì)胞內(nèi)部分由于涉及到細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)，相對比較復(fù)雜，不僅有TGF-β1自身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路每個環(huán)節(jié)的調(diào)控，也同時存在其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交叉調(diào)節(jié)，以及各個通路之間的整合或互相拮抗。因此，TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)是復(fù)雜而精密的。正是由于有如此精密的調(diào)控系統(tǒng)的存在，才使得TGF-β1能在不同環(huán)境下發(fā)揮它的多種功能，產(chǎn)生各種效應(yīng)。

正常成纖維細(xì)胞合成TGF-β1后并非直接分泌到細(xì)胞外發(fā)揮功能，而是與特定的蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合體，以較大的前體形式存在于細(xì)胞中[7]。這些蛋白質(zhì)包括：LAP（Latency associated peptide, LAP）、LTBP（Latent TGF-β1binding protein）等。它們在復(fù)合體中能夠幫助TGF-β1的正確折疊并保持其穩(wěn)定性，并使其易于分泌。本實驗采用ELISA方法檢測HSF分泌到細(xì)胞外的TGF-β1水平，表明HSF分泌較多的TGF-β1，這與上述HSF的高代謝、高分泌狀態(tài)相一致。

Heckenkamp等[8]在抑制靜脈血管再狹窄的研究中發(fā)現(xiàn)，PDT治療后第3和第7天，成纖維細(xì)胞的增殖能力分別減少了30%和76%，其所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也分別減少了47%和51%，并推測該效應(yīng)的產(chǎn)生與TGF-β1mRNA的表達(dá)顯著降低密切相關(guān)。Gold等[9]已證實TGF-β1能夠在成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，提示瘢痕形成涉及成纖維細(xì)胞向TGF-β1的高敏性轉(zhuǎn)換和積累，并且這類高敏的成纖維細(xì)胞未能及時消亡而且仍然分泌TGF-β1形成正反饋。所以，通過各種方法下調(diào)或?qū)筎GF-β1是目前防治瘢痕的方向之一。

研究表明[10]HMME的主要成分為相對疏水性卟啉，易結(jié)合于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等膜性結(jié)構(gòu)。HSF細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，高爾基體發(fā)達(dá)，以及線粒體數(shù)目大量增加，HMME進(jìn)入HSF后以這些細(xì)胞器為主要分布位點，經(jīng)激光照射產(chǎn)生反應(yīng)活性很高的自由基和單線態(tài)氧等ROS，導(dǎo)致亞細(xì)胞水平多位點損傷。由于蛋白合成的場所——粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體受PDT損傷，從而抑制了細(xì)胞合成與分泌TGF-β1等蛋白的能力。本實驗結(jié)果亦表明HMME-PDT能夠抑制HSF分泌TGF-β1，其表達(dá)水平顯著降低。本實驗采用ELISA的方法檢測到，HMME-PDT組HSF分泌TGF-β1蛋白減少，故筆者推測正是由于HMME-PDT阻滯細(xì)胞的高增殖和高分化，導(dǎo)致其自身合成TGF-β1蛋白的能力下降，遞呈給TβRⅠ的信息減少，進(jìn)一步抑制HSF的增殖。此外，由于HMME易于在細(xì)胞膜性細(xì)胞器積聚，故推測細(xì)胞膜必然也是HMME結(jié)合和積聚的位點。經(jīng)PDT治療后必然會損傷細(xì)胞膜，分布于細(xì)胞膜上的TGF-βR功能亦受損，影響細(xì)胞外信號TGF-β1向細(xì)胞內(nèi)有效傳導(dǎo)。

HS的攣縮影響皮膚的正常外觀和功能，在攣縮過程中HSF向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）分化，它是成纖維細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合或攣縮過程中的一種終極表型，Adam等在α-SMA基因啟動子序列中發(fā)現(xiàn)了一個TGF-β1調(diào)控位點（TGF-β1Control Element，TCE），提出TGF-β1本身可以直接參與到MFB的分化，并認(rèn)為除了TCE外，TGF-β1還作用于內(nèi)源性的CArG[CC(A/T)6GG]控制元件調(diào)控成纖維細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，抗體靶向光分解(antibodytargeted photolysis, ATPL)對于體外控制FPCLs收縮是一種具有高選擇性和有效的方法，通過改變光敏劑和光劑量等PDT參數(shù)，能減少FPCLs的收縮程度，為調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生提供可能。本實驗的研究結(jié)果表明，HMME-PDT抑制體外培養(yǎng)的HSF自分泌和合成TGF-β1蛋白，終而可能會通過TCE或其它相關(guān)控制元件影響MFB的分化和α-SMA蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制瘢痕攣縮的作用。

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The Investigation of Transforming Growth Factor β1in HSF after HMME-PDT

CAI Hong1,WANG Yi-xia1,LI You1,LIU Wei1,SUN Ping1,DONG Ning2
(1.Department of Dermatology, The General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China;2. Burns Institute, the First Hospital Affiliated to the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100037,China)

ObjectiveTo investigate the response of TGF-β1after PDT which induced by hematoporphyrin monomerthyl ether (HMME) in human fibroblasts from hypertrophic scar (HSF).MethodsFibroblasts were cultured from nontreated hypertrophic scars, and cells were divided into 4 groups: control (untreated), HMME-PDT, HMME and Laser. The expression of TGF-β1in supernatant of HSF was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of TGF-β1was analyzed by Western blot.ResultsHMME-PDT down-regulated the protein level of TGF-β1both in supernatant of HSF and in HSF.ConclusionHMME-PDT decreased TGF-β1activation. It inhibited the proliferation of HSF through decreased the activation of taget gene.

Photodynamic therapy; laser; Photosensitizer; hypertrophic scar fibroblast; TGF-β1

R619+.6

A

1008-6455（2017）02-0005-04

2016-07-19

2016-11-23

編輯/張惠娟

本研究受國家自然科學(xué)基金資助（光動力學(xué)療法作用于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞 TGF-β1/Smad3 信號通路的分子機(jī)制：編號81301386）

劉瑋，教授，主任醫(yī)師，地址：北京海淀區(qū)阜成路30號，郵編：100142；E-mail：lwei5811@126.com