許海艦，劉翠哲

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究進(jìn)展

許海艦，劉翠哲△

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）；基本原理；應(yīng)用進(jìn)展

20世紀(jì)70年代，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù) 開始出現(xiàn)，當(dāng)時的場解吸（FD）離子化技術(shù)雖然能測定分子量1500～2000Da的非揮發(fā)性物質(zhì)，但重復(fù)性差。后來出現(xiàn)的快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），對分子量較大的多肽類化合物測定效果良好。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更加精密的化合物分析質(zhì)譜法—電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和大氣壓化學(xué)電離源質(zhì)譜法（APCI-MS）應(yīng)運而生。本文對近年來LC-MS的研究應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 質(zhì)譜儀器

1.1 質(zhì)譜分析法的基本原理 質(zhì)譜分析法是將物質(zhì)離子化，并按照質(zhì)荷比分離，通過測量各離子峰的強(qiáng)度達(dá)到分析目的。以檢測器檢測到的離子信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，離子質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，所作的條狀圖就是常見的質(zhì)譜圖。

1.2 質(zhì)譜儀的組成

1.2.1 真空系統(tǒng)：由機(jī)械真空泵、擴(kuò)散泵或分子泵組成，以抽取離子源和分析器等部分的真空。只有真空度足夠高，離子才能從離子源到達(dá)接收器，真空度不夠則靈敏度降低。

1.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)：是將所分析的樣品導(dǎo)入離子源的裝置，包括直接進(jìn)樣、加熱進(jìn)樣和參考物進(jìn)樣等。

1.2.3 離子源：是使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)，同時對帶電粒子加速，使其進(jìn)入分析器的裝置，目前使用的離子源主要是電噴霧離子源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）。（1）ESI：樣品流出毛細(xì)管噴口，在霧化氣（N2）和強(qiáng)電場（3-6kV）的作用下迅速霧化，產(chǎn)生高電荷液滴，伴隨液滴揮發(fā)電場也隨之加強(qiáng)，此時離子移至液滴表面并揮發(fā)，產(chǎn)生單電荷或多電荷離子。一般生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，小分子得[M+H]+或[M-H]-單電荷離子。（2）APCI：樣品流出毛細(xì)管，通過氮氣流霧化到加熱管中被揮發(fā)，加熱管Corona尖端放電電極使溶劑分子形成反應(yīng)氣等離子體，樣品分子和等離子體通過氫質(zhì)子交換被電離，形成[M+H]+或[M-H]-進(jìn)入質(zhì)譜儀。

1.2.4 質(zhì)量分析器：現(xiàn)有的質(zhì)量分析器有串聯(lián)四極、三重四極桿分析器等。

1.2.5 檢測接收器：是接收離子束流的裝置，包括電子倍增器、光電倍增器和微通道板。

2 LC-MS分析條件的選擇

2.1 離子源的選擇 ESI是最軟的電離技術(shù)，適合分析中極性、強(qiáng)極性化合物分子，尤其是在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可獲得多個質(zhì)子的大分子。APCI亦為軟電離技術(shù)，適合分析弱極性小分子物質(zhì)，不適合分析帶多個電荷的大分子。

2.2 正、負(fù)離子模式的選擇 正離子模式用于分析堿性樣品，樣品由甲酸或乙酸酸化后進(jìn)行分析。樣品中含仲氨或叔氨的應(yīng)優(yōu)先考慮使用正離子模式。負(fù)離子模式用于分析酸性樣品，由三乙胺或氨水堿化樣品后分析，適合分析含較多強(qiáng)伏電性基團(tuán)的樣品，如含氯、含溴或多個羥基時可嘗試使用負(fù)離子模式。

2.3 流動相的選擇 常用的流動相為甲醇、乙腈、水及不同比例的混合物，或一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，還可通過加入酸、堿調(diào)節(jié)pH值。LC-MS接口須避免進(jìn)入不揮發(fā)性、含磷和氯的緩沖液；流動相中含鈉和鉀的成分應(yīng)＜lmmol/L，醋酸銨＜5mmol/L，甲酸＜2%、三乙胺＜l%、三氟乙酸0.5%。進(jìn)樣前，為達(dá)到基本分離，應(yīng)摸好液相條件，且緩沖體系應(yīng)符合質(zhì)譜要求。

2.4 流量和色譜柱的選擇 不加熱ESI目前一般用lmm～2.1mm內(nèi)徑微柱，最佳流速(1～50)μl/min；采用內(nèi)徑4.6mm的LC柱時要求柱后分流。APCI常規(guī)使用直徑4.6mm的色譜柱，最佳流速lml/min；小于100mm的短柱可提高分析效率，節(jié)省定量分析的時間。

3 LC-MS的應(yīng)用進(jìn)展

3.1 雜質(zhì)的分析 藥物在生產(chǎn)、運輸和保存過程中，容易引入或自身產(chǎn)生無治療作用、影響藥物穩(wěn)定性和療效的雜質(zhì)，甚至對人體健康有害的物質(zhì)。雜質(zhì)通常量低、種類多，結(jié)構(gòu)和主藥類似，很難檢測。雜質(zhì)的一般檢測方法有TLC、HPLC、NMR和IR，但靈敏度低，在雜質(zhì)控制方面的應(yīng)用受到限制[1]。LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離性和質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性，能提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息，極大地推動了雜質(zhì)研究的發(fā)展[2]。

頭孢菌素是最常用的抗生素，具有高效、低毒的特點[3]。頭孢菌素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在生產(chǎn)和運輸過程中易產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物和聚合物，從而失去抗菌活性，甚至產(chǎn)生毒性，在生產(chǎn)過程中要嚴(yán)格控制雜質(zhì)的量。LC-MS聯(lián)用技術(shù)在頭孢菌素降解產(chǎn)物[4]、食品中殘留物[5]和生物樣品中代謝產(chǎn)物[6-7]等檢測方面取得了長足的進(jìn)步。Rourick等[4]人用液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法考察了在酸、堿等不同條件下頭孢羥氨芐的降解規(guī)律，解析了可能的降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，包括△3-異構(gòu)體、7S構(gòu)型的差向異構(gòu)體、開環(huán)物、哌嗪二酮衍生物、頭孢羥氨芐亞砜等。

隨著LC-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，其在雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用更加廣泛，尤其是原料藥雜質(zhì)譜的分析，在對藥物中存在的已知雜質(zhì)進(jìn)行鑒別的同時，也可推導(dǎo)未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。楊昊等[8]用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-IT-MSn）法建立了慶大霉素Cla雜質(zhì)譜的分析方法，結(jié)果顯示慶大霉素Cla可與主要雜質(zhì)分離，并從慶大霉素Cla的原料中檢測出13個雜質(zhì)，解析了其中12個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，主要是慶大霉素A、B、小諾霉素、西索米星、威達(dá)米星或其同分異構(gòu)體和同系物，以及慶大霉素Cla和上述雜質(zhì)的降解產(chǎn)物。

飛行時間質(zhì)譜儀（TOF-MS）為高靈敏度、高選擇性的高分辨質(zhì)譜，能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖，以及化合物的精確相對分子質(zhì)量，適合大分子化合物的分析[9]。崔宏霞等[10]建立了液相高分辨飛行時間質(zhì)譜（LC-TOF/HR-MS）法，按照英國和美國藥典規(guī)定的可能有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)對比，初步鑒定了氯吡格雷的18個主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，且將雜質(zhì)分成了4類。Wang等[11]用液相飛行質(zhì)譜-離子阱質(zhì)譜（LC-TOF/MS-IT/MS）法對羅紅霉素中19個雜質(zhì)進(jìn)行研究，通過對質(zhì)譜碎片的分析，歸屬了所有雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。Adouani等[12]在地奧司明有關(guān)物質(zhì)研究中，根據(jù)LC-MS和四級桿-飛行時間（Q-TOF）質(zhì)譜法的結(jié)果，推斷出了一種新雜質(zhì)。Raman等[13]采用LC-MS/MS和液相-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（LC-Q-TOF/MS）法對依折麥布制備工藝中產(chǎn)生的雜質(zhì)I進(jìn)行了初步分析，推測其結(jié)構(gòu)為2-(4-鄰羥芐基)-N，5-順-(4-氟代苯基)-5-羥基戊酰胺，并用NMR和IR進(jìn)一步確證。

3.2 藥代動力學(xué)研究 藥物動力學(xué)研究需對生物樣品中微量乃至痕量成分作定量分析。目前，藥物的研制趨于低劑量，采用常規(guī)的分離檢測技術(shù)很難準(zhǔn)確定量復(fù)雜介質(zhì)中的痕量成分。LC-MS技術(shù)為體內(nèi)藥物分析中的藥代動力學(xué)、藥物代謝的研究提供了一種高效、可靠的分析手段。

尼莫地平為1，4-二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，對腦組織受體有高度選擇性，容易透過血腦屏障，能通過有效地阻止鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、抑制平滑肌收縮，達(dá)到解除血管痙攣的目的，從而保護(hù)腦神經(jīng)元、穩(wěn)定腦神經(jīng)元的功能及增進(jìn)腦血灌流，改善腦供血，提高腦組織對缺氧的耐受力。吳華等[14]建立了測定人體血漿中尼莫地平含量（尼群地平為內(nèi)標(biāo)）的LC-MS法，研究20名健康男性志愿者口服尼莫地平受試制劑和參比制劑后的藥物動力學(xué)，為臨床用藥提供指導(dǎo)。

羥基紅花黃色素A[15]（hydroxysafflor yellow A）是具有單查爾酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物，是紅花藥理功效最高的水溶性部位，可抑制血小板激活因子誘發(fā)的血小板聚集與釋放，競爭性抑制血小板激活因子與血小板受體的結(jié)合。李長印等[16]建立了液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（SPE-LC-MS/MS）法測定人血漿中羥基紅花黃色素A（QA）濃度的分析方法。

頭孢克肟（Cefixime）為口服第三代頭孢菌素類抗生素，主治敏感菌所致呼吸、泌尿和膽道等部位的感染。為研究頭孢克肟是否適合聯(lián)用其它藥物用于口腔科感染性疾病，黃開明等[17]建立了LC-MS/MS法測定大鼠尾靜脈注射頭孢克肟后不同時間點在口腔組織分布情況和藥動學(xué)特征，以期為臨床規(guī)范、合理用藥提供理論依據(jù)。

體內(nèi)一氧化氮與活性氧反應(yīng)生成的過氧亞硝基陰離子，可影響體內(nèi)蛋白、脂質(zhì)和DNA的硝化和氧化，且極不穩(wěn)定，很難定量。據(jù)報道，過氧亞硝基陰離子能與游離或結(jié)合型色氨酸反應(yīng)，生成3-硝基色氨酸，穩(wěn)定性良好，故3-硝基色氨酸被廣泛用作體內(nèi)產(chǎn)生活性氮的生物標(biāo)記。但硝基化色氨酸量的增加，會影響相關(guān)蛋白和細(xì)胞的功能，并引發(fā)多種代謝性疾病。同時，各組織中的3-硝基色氨酸量低，含量差異大，在體內(nèi)很難對其準(zhǔn)確定量。Li等[18]建立了用LC-MS/MS測定3-硝基色氨酸的分析方法，實現(xiàn)了對色氨酸和3-硝基色氨酸的分離。

4 展望

LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜的高分離性和質(zhì)譜的強(qiáng)鑒別力，專屬性高，對多數(shù)藥物的檢測靈敏度優(yōu)于其它分析方法，定量測試速度亦明顯加快。該技術(shù)可解析混合物中微量組分的結(jié)構(gòu)，達(dá)到現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析研究中高通量和高精度的要求，成為了藥代動力學(xué)和藥物代謝研究的核心分析技術(shù)。隨著現(xiàn)代高新技術(shù)的不斷發(fā)展，LC-MS聯(lián)用技術(shù)必將在體內(nèi)藥物分析的研究中擁有不可或缺的地位。

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R927.2

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2017-03-26）