李景 朱丹婷 俞立英

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院口腔科，上海 200040;2.靜安區(qū)牙病防治所，上海 200040)

白念珠菌主要的毒性表現(xiàn)為芽孢與菌絲之間的形態(tài)轉(zhuǎn)換以及形成生物膜的能力。機(jī)體對(duì)對(duì)白念珠菌的防御主要是:吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用,并通過(guò)呼吸爆發(fā)釋放活性氧等物質(zhì)[1]。白念珠菌的氧化應(yīng)激機(jī)制近年來(lái)開(kāi)始受到關(guān)注[2-3]。

UVA已被證實(shí)可誘導(dǎo)真核細(xì)胞 (包括白念珠菌)產(chǎn)生ROS，破壞DNA結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UVA照射后白念珠菌胞內(nèi)有ROS生成，清除胞內(nèi)ROS可有效保護(hù)白念珠菌，逃避UVA對(duì)其的殺傷作用[4]。

Amorim-Vaz S等[5]用白念珠菌感染小鼠，用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)到了約86%以上的白念珠菌基因。并且發(fā)現(xiàn)在其體內(nèi)調(diào)節(jié)基因中，有10%都還是未知功能。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，深入探討UVA對(duì)白念珠菌菌絲及生物膜形成的影響機(jī)制，應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)分析UVA實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因；篩選出UVA作用后與白念珠菌生物膜相關(guān)的關(guān)鍵基因，加深UVA抑制白念珠菌致病性轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC90028)，由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院真菌室提供。

1.2 方法

菌株生物膜培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)在I型膠原薄膜上培養(yǎng)白念珠菌株 (ATCC90028)，構(gòu)建體外生物膜模型。參照文獻(xiàn)4方法。

UVA處理 用UVA-LED殺菌設(shè)備 (波長(zhǎng)365 nm,照射強(qiáng)度13 mW/cm2，頻率100 Hz)，對(duì)白念珠菌生物膜分別滅活5 min (UVA-5)，10 min (UVA-10)，15 min (UVA-15)，對(duì)照 (Control)組不光照。

總RNA的提取和RNA-seq高通量測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)分析 收集UVA光照后UVA-5、UVA-10、UVA-15三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和Control組一共4份白念珠菌菌液，按照Trizol法的操作步驟提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用Agilent2100 Bioanalyzer生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。RNA文庫(kù)構(gòu)建使用Illumina公司生產(chǎn)的TruSeq RNA Sample Preparation Kit試劑盒，使用oligo-dT磁珠從總RNA里分離出帶有poly-A尾巴的RNA，即mRNA。mRNA片段化后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈和第二鏈，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做末端修復(fù)；3’末端加A并連接測(cè)序接頭，其中一個(gè)接頭帶有特異性的barcode序列，用以區(qū)分樣本的來(lái)源。連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。建好的RNA文庫(kù)用Illumina HiSeq 2500型測(cè)儀進(jìn)行測(cè)序。采用FPKM法進(jìn)行基因的表達(dá)量計(jì)算，4組樣品都進(jìn)行t檢驗(yàn),將2組間FPKM差異倍數(shù) (fold change)≥2且P≤0.05的基因定為差異基因。用BlastGo軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和KEGG Pathway富集分析。

本實(shí)驗(yàn)分析的樣品組合為Control vs UVA-5、Control vsUVA-10、Control vsUVA-15，表示以Control為對(duì)照組，UVA分別光照5 min、10 min和UVA-15 min為實(shí)驗(yàn)組。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提取和質(zhì)檢結(jié)果

RNA的質(zhì)量直接影響轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的分析結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA質(zhì)量有著非常嚴(yán)格的要求。本實(shí)驗(yàn)中用Agilent2100 Bioanalyzer生物分析儀對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。結(jié)果顯示：4個(gè)樣本樣品總量均大于1.5 μg，濃度均大于15 μg/μL，RIN值均在7左右，且OD260/280=1.8-2.1 (見(jiàn)圖1、表1)。對(duì)RNA的完整性進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果表明：RNA無(wú)拖尾，無(wú)明顯降解 (見(jiàn)圖2)。證明RNA質(zhì)檢合格，滿足RNA-seq對(duì)樣品質(zhì)量的要求。

表1 RNA提取和質(zhì)檢結(jié)果

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

本次測(cè)序的4個(gè)樣品總堿基數(shù)為13.1G，共109.68M條Reads，Q30的比例均大于90%，使用Tophat將4個(gè)樣品的reads與白念珠菌參考基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并對(duì)符合比對(duì)要求的reads分類注釋，滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析的要求 (見(jiàn)表2)。應(yīng)用FPKM值量化基因的表達(dá)水平。

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)出

2.3 差異基因分析

基因差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，UVA-5相對(duì)Control組有728個(gè)差異基因，其中521個(gè)上調(diào)，207個(gè)下調(diào)。可見(jiàn)白念珠菌生物膜在UVA照射后，基因表達(dá)已經(jīng)有了一定差異。UVA-10相對(duì)Control組有558個(gè)差異基因，345個(gè)上調(diào)，213個(gè)下調(diào)；UVA-15min相對(duì)Control組有556個(gè)差異基因，361個(gè)上調(diào)，195個(gè)下調(diào)，見(jiàn)表3。

表3不同樣品組合間的差異表達(dá)基因

Tab.3The DEGs (differentially expressed genes) in different sample groups

組合差異基因總數(shù)上調(diào)基因數(shù)量下調(diào)基因數(shù)量ControlvsUVA?5728521207ControlvsUVA?10558345213ControlvsUVA?15556361195

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UVA-5相對(duì)于Control的差異基因并未完全覆蓋UVA-10和UVA-15相對(duì)于Control的差異基因。這也說(shuō)明UVA照射下白念珠菌參與應(yīng)激與防御機(jī)制的途徑和基因變化比較復(fù)雜。

Control vs UVA-5、Control vs UVA-10和Control vs UVA-15三個(gè)組合共有的上調(diào)基因66個(gè)，下調(diào)基因70個(gè) (見(jiàn)圖3)。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

通過(guò)Go數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述差異基因聚類分析，顯著富集的GO條目主要涉及定植、形態(tài)轉(zhuǎn)換、生物膜結(jié)構(gòu)組成等 (見(jiàn)圖4)。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway分析

通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因開(kāi)展了Pathway分析 (FDR<0.05)，顯著富集的通路主要有核糖體合成、氨基糖和核苷糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工途徑、RNA降解途徑和細(xì)胞內(nèi)吞作用等 (見(jiàn)圖5)。其中編碼核糖體的RIO2基因；編碼細(xì)胞色素b5的MCR1、CBR1基因，蛋白質(zhì)降解相關(guān)蛋白SHP1基因顯著上調(diào)染色質(zhì)修飾蛋白CHMP6基因，金屬磷酸二酯酶超家族蛋白MPP6基因顯著下調(diào) (見(jiàn)表4)。

3 討 論

白念珠菌在應(yīng)答UVA輻射時(shí)，是由多個(gè)代謝或信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)快速有效的準(zhǔn)確獲得光照組和對(duì)照組所有差異表達(dá)基因，通過(guò)GO和KEGG分析得到基因的功能和參與的代謝通路。

UVA已被證實(shí)可誘導(dǎo)真核細(xì)胞 (包括白念珠菌)產(chǎn)生ROS，從而破壞DNA結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。在氧化脅迫下，真菌可以通過(guò)改變核糖體RNA串聯(lián)基因以適應(yīng)外界環(huán)境和生長(zhǎng)[6-7]。而RI02激酶是細(xì)胞進(jìn)入S2細(xì)胞周期及完成有絲分裂的必要因素，因此，RI02的缺失對(duì)細(xì)胞是致命的[8-9]。

在氨基糖和核苷酸的糖代謝途徑中，細(xì)胞色素b5 (Cytb5)合成相關(guān)基因是MCR1、CBR1，Cytb5參與生物體組織中一系列重要的氧化還原反應(yīng),如脂質(zhì)和類固醇的合成代謝等。它通過(guò)與調(diào)節(jié)活性氧物質(zhì) (ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中Cytb5合成相關(guān)基因MCR1、CBR1顯著上調(diào)；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工途徑中，蛋白質(zhì)需經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)折疊，如果發(fā)生錯(cuò)誤折疊的、需要被降解的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，會(huì)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。長(zhǎng)期過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡[12]。SHP1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和DNA損傷應(yīng)答過(guò)程[13]。

我們推測(cè)，光照組通過(guò)上調(diào)RIO2、MCR1、CBR1、SHP1這些基因，使白念珠菌對(duì)外界刺激更加敏感，能夠及時(shí)將信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部做出反應(yīng)。

金屬磷酸二酯酶超家族蛋白 (MPP)在參與二腺苷多聚磷酸 (ApnA)的代謝過(guò)程有重要作用[14-17]，ApnAs在體內(nèi)積累會(huì)對(duì)如腺苷酸激酶和蛋白激酶等的活性有抑制作用。同時(shí)，MPP參與很多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞通路過(guò)程，DNA修復(fù)和RNA成熟過(guò)程等[18-20]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到MPP表達(dá)顯著下降。

囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分類涵體 (ESCRT)系統(tǒng)參與調(diào)控跨膜蛋白質(zhì)降解過(guò)程中的一類重要復(fù)合物。ESCRT主要介導(dǎo)真菌出芽過(guò)程、細(xì)胞自噬作用和感知環(huán)境pH值。ESCRT中的CHMP6蛋白是作為囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分類復(fù)合體亞單位[21]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到下調(diào)CHMP6、MPP6基因下調(diào)，它們可能在白念珠菌接受UVA脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

UVA作用白念珠菌的途徑是非常復(fù)雜的。目前，將轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)用到UVA對(duì)白念珠菌生物膜作用研究不多。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，鑒定出白念珠菌應(yīng)答UVA輻射的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過(guò)程等路徑相關(guān)基因，為以后進(jìn)一步探討白念珠菌生物膜應(yīng)答UVA輻射的分子機(jī)制提供了有效的信息平臺(tái)。還有不少需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。下一步我們將從中選擇部分基因進(jìn)行后續(xù)的研究及功能分析，從而更加細(xì)致的闡明白念珠菌致病基因的機(jī)制。

圖1由Agilent 2100 Bioanalyzer獲得的總RNA質(zhì)檢結(jié)果圖21.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA圖3Control vs UVA-5、Control vs UVA-10和Control vs UVA-15的上調(diào)基因 (A)及下調(diào)基因 (B)圖4顯著GO條目統(tǒng)計(jì)圖5顯著pathway統(tǒng)計(jì)

Fig.1Quality test results of total RNA with Agilent 2100Fig.2RNA tests by 1.5% agarose get electrophoresisFig.3Up-regulated (A) and down-regulated (B) genes in Control vs UVA-5,Control vs UVA-10,Control vs UVA-15Fig.4Statistic of significant GO termsFig.5Statistic of significant pathways

表4 部分差異表達(dá)基因

注：a.基因調(diào)控模式，其中“+”代表基因上調(diào)，“-”代表基因下調(diào);b.P<0.05說(shuō)明該基因被顯著富集到特定代謝途徑上

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