晏亮 鄧淑文,2 張東興 潘煒華 廖萬清

(1.上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市醫(yī)學(xué)真菌研究所 上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所 全軍皮膚病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200433；2.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘇州 215129；3.廣東省梅州市人民醫(yī)院皮膚科，梅州 514028)

外陰陰道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是僅次于細(xì)菌性陰道炎的第二常見的陰道感染性疾病，影響了眾多女性健康[1]。本研究檢測了VVC患者陰道分泌物分離的53株念珠菌對11種抗真菌藥物的體外敏感性，為VVC臨床用藥提供信息。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集上海長征醫(yī)院婦科門診2016年10月～2017年1月VVC患者陰道分泌物分離的念珠菌共53株。以近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258作為質(zhì)控菌株。

1.2 方法

真菌培養(yǎng)與鑒定 采用無菌棉拭子在VVC患者的陰道后穹隆處取分泌物置于無菌管內(nèi)，接種于科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)24～48 h后初步判斷菌種，初次培養(yǎng)分離后轉(zhuǎn)種于沙氏培養(yǎng)基，30℃條件下培養(yǎng)48 h。提取菌株DNA后 (Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR,Takara)，以NL-1 (5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)和NL-4 (5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增26S核糖體基因D1/D2區(qū)序列[2]，PCR產(chǎn)物送至美吉測序公司測序，所得序列在BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確認(rèn)菌種。

藥敏方法 共檢測11種藥物，分別為：阿尼芬凈 (Ani)、卡泊芬凈 (Cas)、米卡芬凈 (Mic)、兩性霉素B (AmB)、5-氟胞嘧啶 (5-FC)、氟康唑 (Flu)、伊曲康唑 (Itr)、伏立康唑 (Vori)、泊沙康唑 (Posa)、艾莎康唑 (isavuconazole,Isa)、雷夫康唑 (ravuconazole,Rav)。參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會 (CLSI)推薦的M27-A3和M27-S4 (肉湯微量稀釋法參考方案)進(jìn)行藥敏測定，重復(fù)3次以保證數(shù)據(jù)可靠性[3-4]。各藥物的濃度范圍、MIC判讀時間、白念珠菌MIC解讀折點(diǎn)見表1。泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑這三種新三唑類藥物尚無明確的MIC解讀折點(diǎn)，參照國外文獻(xiàn)，對念珠菌MIC≤1 μg/mL定義為敏感[5-7]。

兩株質(zhì)控菌株對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈的MIC值均在質(zhì)控范圍內(nèi) (對三種新三唑類藥物尚無質(zhì)控范圍數(shù)值)。

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定

53例VVC分離培養(yǎng)的致病菌以白念珠菌為主，為49例 (92.4%)，其次為光滑念珠菌2株 (3.8%)，熱帶念珠菌1株 (1.9%)，釀酒酵母1株 (1.9%)。

2.2 藥敏結(jié)果

49株白念珠菌對11種抗真菌藥物的敏感性結(jié)果見表2。

表1藥物濃度范圍、MIC判讀時間、解讀折點(diǎn)

Tab.1Drug concentration ranges,time of MIC reading,interpretive breakpoints

藥物藥物濃度范圍(μg/mL)MIC判讀時間白念珠菌MIC范圍(μg/mL)SSDDRAni0．016?824h≦0．250．5≧1Cas0．016?824h≦0．250．5≧1Mic0．016?824h≦0．250．5≧1AmB0．0313?1624h≦1?a≧25?FC0．125?6448h≦48?16≧32Flu0．0313?1624h≦24≧8Itr0．0313?1648h≦0．1250．25?0．5≧1Vori0．0313?1648h≦0．1250．25?0．5≧1Posa0．0313?1648h≦1??Isa0．0313?1648h≦1??Rav0．0313?1648h≦1??

注：a.暫無解讀標(biāo)準(zhǔn);S.敏感,SDD.劑量依賴,R.耐藥

表249株白念珠菌對11種抗真菌藥物的敏感性

Tab.2Antifungal susceptibility of 49Candidaalbicansisolates to 11 antifungal agents

藥物MIC(μg/mL)范圍MIC50/90GMSSDDRAni0．016?0．03130．016/0．03130．02100．0%0．0%0．0%Cas0．0625?10．25/0．50．2277．6%20．4%2．0%Mic0．016?0．03130．016/0．03130．02100．0%0．0%0．0%AmB0．25?21/10．8695．9%?4．1%5?FC0．125?>642/41．2993．9%2．0%4．1%Flu0．125?82/41．0765．3%30．6%4．1%Itr0．0313?160．25/0．50．1844．9%46．9%8．2%Vori0．0313?>161/40．3842．9%6．1%51．0%Posa0．031?20．25/10．2498．0%??Isa0．031?40．125/0．50．1295．9%??Rav0．031?40．125/0．50．1395．9%??

從表2中可以看出所有白念珠菌分離株對阿尼芬凈和米卡芬凈均敏感，絕大多數(shù)白念珠菌分離株對兩性霉素B、5-FC和三種新三唑類藥物敏感，大部分對卡泊芬凈和氟康唑敏感；而對伊曲康唑和伏立康唑，白念珠菌分離株體外敏感性較差，敏感率小于50%。

4株非白念珠菌對11種抗真菌藥物的MIC值見表3。因本研究中收集的非白念珠菌數(shù)目少，而且對各種非白念珠菌的體外藥敏解讀折點(diǎn)尚不全面，此處并未根據(jù)4株非白念珠菌對11種抗真菌藥物的MIC值進(jìn)行敏感性判定。

表34株非白念珠菌對11種抗真菌藥物的MIC值

Tab.3MICs of 4 non-albicansCandidaspecies isolates to 11 antifungal agents

藥物MIC(μg/mL)釀酒酵母(n=1)熱帶念珠菌(n=1)光滑念珠菌(n=2)Ani0．250．0160．1250．125Cas10．511Mic0．1250．0160．03130．016AmB0．251115?FC0．1250．1250．1250．125Flu10．5864Itr0．50．1250．58Vori0．250．250．1251Posa10．2512Isa0．1250．06250．251Rav0．1250．06250．1251

3 討 論

VVC是育齡期女性的常見病，約70%～75%的婦女一生中至少有過1次VVC病史[1]。局部外用咪唑類制劑和口服氟康唑是VVC的一線治療[8]，隨著OTC抗真菌藥物的濫用和治療周期的過分延長，VVC念珠菌對這些唑類耐藥也時有發(fā)生，因此藥敏監(jiān)測對指導(dǎo)臨床用藥有重要意義。

現(xiàn)有的抗真菌藥可分為以下5類：多烯類 (制霉菌素和兩性霉素B)、唑類 (分為咪唑類和三唑類)、核苷類 (灰黃霉素、5-氟胞嘧啶)、烯丙胺類 (特比萘芬等)、棘白菌素類 (阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈等)[9]，而用于VVC治療的一線抗真菌藥為咪唑類 (克霉唑、咪康唑、噻康唑、布康唑、特康唑等)和氟康唑[8]；制霉菌素外用制劑和伊曲康唑口服制劑在臨床也較常使用；5-FC外用、兩性霉素B外用、5-FC聯(lián)合兩性霉素B外用均有報(bào)道用于傳統(tǒng)治療失敗的非白念珠菌引起的復(fù)雜性VVC，并有不錯的療效 (真菌學(xué)治愈率70%～100%)[10-13]；棘白菌素類和泊沙康唑尚未應(yīng)用在VVC的治療上，主要應(yīng)用在系統(tǒng)性念珠菌感染中[14]，德國一研究報(bào)道了應(yīng)用口服泊沙康唑結(jié)合外用環(huán)丙酮胺治療光滑念珠菌引起的RVVC患者，15例中14例獲得了臨床和真菌學(xué)治愈[15]。艾莎康唑、雷夫康唑是廣譜抗真菌的新三唑類藥物，分別處于念珠菌病的III、II期臨床試驗(yàn)中，在系統(tǒng)性念珠菌病分離的念珠菌體外藥敏試驗(yàn)中已經(jīng)證明活性良好[16-17]，但尚無其對VVC分離念珠菌的體外敏感性數(shù)據(jù)。

應(yīng)春妹等[18]報(bào)道在115株來源于上海三家醫(yī)院VVC患者的白念珠菌對氟康唑的敏感率為83%、對伏立康唑敏感率為81%，該研究中氟康唑和伏立康唑的敏感率均明顯高于本研究的結(jié)果。楊連娟等[19]報(bào)道了67株VVC分離念珠菌對伊曲康唑的敏感率為48.1%，與我們的結(jié)果類似。王東江[20]報(bào)道了59株非復(fù)發(fā)性VVC分離白念珠菌對7種抗真菌藥的體外敏感性，這些白念珠菌對氟康唑、伏立康唑、5-FC、阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率與我們的結(jié)果類似，但其對伊曲康唑 (81.4%)和卡泊芬凈 (100%)的敏感率則高于我們的結(jié)果。吳永琴等[21]報(bào)道了93 株VVC分離的白念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-FC、兩性霉素B的耐藥率分別為6.5%、24.5%、2.2%、2.2%、0%，氟康唑、伊曲康唑、5-FC、兩性霉素B的耐藥率與本研究差異不大，但對伏立康唑的耐藥率明顯低于本研究 (伏立康唑的耐藥率為51.0%)，這明顯的差異可能與兩個研究應(yīng)用的伏立康唑解讀折點(diǎn)不同有關(guān) (本研究:MIC≥1 μg/mL判定為耐藥,吳永琴等人的研究：MIC≥4 μg/mL判定為耐藥)。

我們的研究中，95%以上的白念珠菌分離株對3個新三唑類藥物敏感，4株非白念珠菌對這三個藥物的MIC值基本也≤1 μg/mL，這提示泊沙康唑、艾莎康唑、雷夫康唑?qū)VC分離念珠菌體外活性良好，有潛力日后應(yīng)用在VVC的治療上，尤其是復(fù)雜性VVC。

本研究中VVC分離念珠菌對唑類、卡泊芬凈、5-FC、兩性霉素B有一定的耐藥性，因此，在臨床工作中，應(yīng)重視VVC的病原菌鑒定及藥敏分析，尤其是復(fù)雜性VVC，這對指導(dǎo)抗真菌藥物的選擇、提高治愈率有十分重要的意義。

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