楊燕 滕隔玲 吳艷華 張琳琳 蓋麗貞 陳影 胡華

(山東省胸科醫(yī)院呼吸科，濟(jì)南 250013)

曲霉在自然界中廣泛存在，免疫抑制狀態(tài)的患者吸入其孢子可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部感染。隨著免疫抑制患者的增多，肺曲霉病發(fā)生率不斷增加。肺曲霉病 (Pulmonary aspergillosis，PA)的發(fā)病是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，與機(jī)體的免疫功能有著重要的聯(lián)系。

甘露聚糖結(jié)合凝集素 (MBL)是人類(lèi)肝細(xì)胞分泌的高度保守的血漿蛋白，為C型凝集素超家族中膠凝素 (Collectins)家族成員。MBL通過(guò)其糖原識(shí)別域 (carbohydrate recognition domain，CRD)能夠識(shí)別多種病原體如細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌等表面的糖結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，抵御病原體的入侵。隨著天然免疫研究發(fā)現(xiàn)膠凝素家族的一些成員和獲得性免疫之間的聯(lián)系越來(lái)越緊密[1]。目前已證實(shí)人MBL可與多種免疫細(xì)胞結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生和發(fā)展[2]。T淋巴細(xì)胞在曲霉獲得性免疫中起非常重要作用[3-5]。本研究通過(guò)檢測(cè)成人肺曲霉病患者中甘露聚糖結(jié)合凝集素 (MBL)的水平、輔助細(xì)胞 (CD4+)、殺傷抑制細(xì)胞 (CD8+)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，來(lái)探討肺曲霉病與患者免疫功能的關(guān)系，為肺曲霉病的免疫增強(qiáng)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2013年5月～2015年5月在我院呼吸科住院臨床確診肺曲霉病的患者51例，參照美國(guó)感染性疾病協(xié)會(huì) (IDSA)2008年曲霉病臨床實(shí)踐治療指南[6]。將納入對(duì)象分為臨床確診：經(jīng)皮肺穿刺標(biāo)本或胸水中檢出曲霉菌絲及曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性；臨床診斷IPA:至少符合1項(xiàng)宿主因素，1項(xiàng)曲霉微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn),且可能感染部位符合1項(xiàng)主要 (或2項(xiàng)次要)臨床標(biāo)準(zhǔn)。痰曲霉培養(yǎng)2次以上陽(yáng)性或經(jīng)纖維支氣管鏡作支氣管肺泡灌洗液曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性；臨床擬診IPA：至少符合1項(xiàng)宿主因素、1項(xiàng)微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)或可能感染部位符合1項(xiàng)主要 (或2項(xiàng)次要)臨床標(biāo)準(zhǔn)。同期健康體檢者52例為健康對(duì)照組。健康查體者均為在我院常規(guī)檢查查體人群，并符合以下條件：近3個(gè)月無(wú)急性呼吸系統(tǒng)感染等相關(guān)疾病，且血中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例和ESR在正常范圍，胸部X線檢查未見(jiàn)異常。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

所有入選患者均要收集分析臨床資料：性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、痰液或體液真菌涂片或培養(yǎng)檢查、胸部CT、血GM、血MBL、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值的檢測(cè)。

標(biāo)本和試劑 入選患者均在未抗真菌治療前抽空腹血清5 mL，留取其上清液置于-20℃冰箱保存。血清MBL試劑盒均購(gòu)自美國(guó)GBD。BIO-RAD model 680，微孔酶標(biāo)儀系伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品，購(gòu)自濟(jì)南芯博生物科技有限公司。曲霉菌半乳甘露聚糖定量檢測(cè)試劑盒由丹娜 (天津)生物科技有限公司提供。同時(shí)2 mL外周靜脈血置于EDTA抗凝管，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN COULTER公司的EPLCS.XL.4Clr流式細(xì)胞儀。

試驗(yàn)方法 采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定，即將標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品加入酶標(biāo)儀反應(yīng)孔內(nèi)，與生物素標(biāo)記的抗體反應(yīng)，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用EPLCS.XL.4Clr流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本分析，報(bào)告CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

所選51例肺曲霉病患者的標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)感染性疾病協(xié)會(huì) (IDSA)2008年曲霉病臨床實(shí)踐治療指南[6]。51例肺曲霉病患者平均年齡49.39±14.25歲，男性29例，女性22例?；A(chǔ)疾病分布情況見(jiàn)表1。所有患者治療前均給予痰涂片及痰真菌培養(yǎng)、胸部CT及GM、MBL、T細(xì)胞亞群檢測(cè)。確診11例：經(jīng)CT引導(dǎo)下肺穿刺病理涂片查到真菌菌絲4例，肺穿刺病灶真菌培養(yǎng)曲霉菌5例，胸腔鏡胸膜活檢病灶真菌培養(yǎng)曲霉菌2例。擬診40例:痰真菌培養(yǎng)到曲霉菌21例，氣管鏡毛刷真菌培養(yǎng)到曲霉菌19例。健康查體者為我院同期查體者，平均年齡42.75±11.33歲，男35例，女性17例。

2.2 胸部CT檢查

表1 51例肺曲霉病患者基礎(chǔ)疾病分布

51例肺曲霉病患者胸部CT中表現(xiàn)多樣化，空洞 (16/51)、實(shí)變影 (22/51)、雙肺多發(fā)不規(guī)則結(jié)節(jié)影 (27/51)、磨玻璃影 (14/51)、囊狀或柱狀支氣管擴(kuò)張 (24/51)、新月征 (11/51)等。

2.3 血GM、MBL結(jié)果

肺曲霉病組 (51例)、健康對(duì)照組 (52例)數(shù)據(jù)正態(tài)分布，肺曲霉病組GM的水平較對(duì)照組高，P<0.05；肺曲霉病組MBL的水平較對(duì)照組低，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2肺曲霉病組與健康對(duì)照組血清GM、MBL濃度比較

Tab.2The serum GM and MBL levels of patients with pulmonary aspergillosis compared with health people

分組nGM(μg/L)MBL(μg/mL)病例組510．94±0．77197．96±148．16對(duì)照組520．32±0．16120．25±98．65P值<0．05<0．05

2.4 血CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值比較

肺曲霉病組患者的外周CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3肺曲霉病組與健康對(duì)照組血CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞百分比，CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值

Tab.3Comparison of the percentages of CD3+CD4+T cells,CD3+CD8+T cells and the ratio of CD3+CD4+/CD3+CD8+T cells between patients group and control group

分組CD3+CD3+CD4+%CD3+CD8+%CD3+CD4+/CD3+CD8+病例組69．50±8．7433．07±7．9733．00±8．291．08±0．47對(duì)照組69．84±6．3840．32±7．3025．98±6．651．68±0．65P值0．82<0．05<0．05<0．05

3 討 論

曲霉菌是一種機(jī)會(huì)性真菌病原體，通常感染免疫功能不全患者[7]。肺曲霉病如果治療處理不當(dāng)，會(huì)引發(fā)系統(tǒng)性曲霉病，死亡率可高達(dá)66.6%～80%[8]。臨床上多見(jiàn)于血液病化療后、腫瘤晚期或結(jié)核等以細(xì)胞免疫抑制為主的患者。疾病發(fā)生時(shí)宿主免疫功能狀態(tài)常常出現(xiàn)紊亂和低下[9]。

人甘露聚糖結(jié)合凝集素 (MBL)在巨噬細(xì)胞吞噬病原體過(guò)程中起重要作用，作為機(jī)體固有免疫中具有多重功能的模式識(shí)別分子，不僅僅參與機(jī)體的天然免疫防御，而且在天然免疫與獲得性免疫之間的相互作用中亦發(fā)揮作用[1]。它能夠通過(guò)MBL糖識(shí)別區(qū)識(shí)別很多病毒/真菌/細(xì)菌等，當(dāng)病原體的糖識(shí)別區(qū)與MBL的糖識(shí)別區(qū)結(jié)合后，MBL的膠原區(qū)就會(huì)跟巨噬細(xì)胞表面上的膠凝集素受體結(jié)合，發(fā)揮吞噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬和殺滅作用。肺曲霉病中MBL不僅與疾病的易感性有關(guān),而且與疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[10]。國(guó)外通過(guò)MBL基因敲除大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)敲除MBL基因更易感染侵襲性曲霉病[11]。在嚴(yán)重的CPA或病情嚴(yán)重的肺曲霉病患者中血清MBL水平明顯升高[12]。本研究結(jié)果也表明，肺曲霉病急性期血清MBL的表達(dá)高于對(duì)照組，提示MBL參與肺曲霉的炎癥反應(yīng)。先天免疫、獲得性免疫與細(xì)胞免疫功能狀態(tài)至關(guān)重要。天然免疫是由多種識(shí)別及效應(yīng)分子組成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原相關(guān)分子模式構(gòu)成機(jī)體抗感染的第一道防線；通過(guò)抗原提呈、提供共刺激信號(hào)和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌,啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答并指導(dǎo)其應(yīng)答的性質(zhì)和強(qiáng)度。

研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞在曲霉獲得性免疫中起非常重要作用[3-4]。CD4細(xì)胞在曲霉感染中起到識(shí)別、趨化作用，是機(jī)體抵御真菌感染的關(guān)鍵因素[13]。CD4+T淋巴細(xì)胞協(xié)調(diào)B細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能,增加機(jī)體對(duì)曲霉的抵抗力。CD8+T淋巴細(xì)胞則抑制抗體的合成、分泌及T細(xì)胞的增殖，其釋放細(xì)胞因子的產(chǎn)生與宿主曲霉感染的進(jìn)展和惡化有一定關(guān)系，兩者比例的穩(wěn)態(tài)維持著機(jī)體正常的免疫應(yīng)答[14]。隨著機(jī)體免疫力水平的下降，CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值水平下降。本研究結(jié)果顯示肺曲霉病組與同期健康對(duì)照組比較CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD3+CD4+/CD3+CD8+T細(xì)胞比值水平均降低，說(shuō)明肺曲霉病患者細(xì)胞免疫水平在真菌感染時(shí)是偏低的，推測(cè)是真菌感染的宿主易感因素。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在抗曲霉感染中起重要作用，不同類(lèi)型的Th細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致宿主對(duì)曲霉抵抗或易感的不同結(jié)局。Hebart[15]在其研究中證實(shí)了感染肺曲霉的小鼠中T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，Th1細(xì)胞因子干擾素-γ幫助實(shí)驗(yàn)小鼠抵抗煙曲霉感染，而Th2細(xì)胞因子IL-5和IL-13則參與了疾病的進(jìn)展[16]。因此對(duì)曲霉感染中T淋巴細(xì)胞免疫始動(dòng)和調(diào)節(jié)的深入研究將有助于發(fā)展新的抗曲霉治療措施[17]。

煙曲霉刺激機(jī)體產(chǎn)生MBL進(jìn)而啟動(dòng)天然免疫[18]，目前研究證實(shí)MBL具有識(shí)別曲霉表面的甘露聚糖、乙酰葡萄糖等外源性糖結(jié)構(gòu)而不與哺乳類(lèi)細(xì)胞上的內(nèi)源性糖類(lèi)結(jié)合。通過(guò)相關(guān)絲氨酸蛋白激酶觸發(fā)一種蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活補(bǔ)體途徑，另外可以通過(guò)微生物表面補(bǔ)體組分如C3b的沉積作用啟動(dòng)調(diào)理性真菌識(shí)別、具有免疫調(diào)理活性[3-4]。目前國(guó)際上對(duì)MBL與獲得性免疫的關(guān)系尚未明確報(bào)道，其免疫調(diào)節(jié)作用的研究較少。Downing等[19]發(fā)現(xiàn)，MBL可與B淋巴細(xì)胞結(jié)合，MBL作為急性期反應(yīng)蛋白,在炎癥發(fā)生時(shí)可在血管外與自身細(xì)胞結(jié)合,參與抗炎反應(yīng)。Fraser等[20]報(bào)道，MBL可抑制細(xì)菌脂多糖刺激的Mo分泌IL-l而促進(jìn)其產(chǎn)生IL-10、IL-6。應(yīng)激狀態(tài)下血液及局部組織MBL濃度增加，不僅可以發(fā)揮天然免疫作用，而且可以結(jié)合自身淋巴細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生和發(fā)展。

本研究證實(shí)了肺曲霉患者病過(guò)程中MBL與T淋巴細(xì)胞關(guān)系密切，因此繼續(xù)探討MBL在肺曲霉病中對(duì)免疫應(yīng)答的指導(dǎo)作用特別是分子機(jī)制的研究，將對(duì)肺曲霉病發(fā)病機(jī)制的研究起重要作用。

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