段強軍 云云 陳志珍 邵菁 汪天明 汪長中

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，合肥 230038；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所,合肥 230038)

中藥復(fù)方白頭翁湯出自《傷寒論》，由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4位中藥組成，臨床治療外陰陰道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis,VVC)效果顯著。本課題組[1-3]通過不同極性溶劑提取白頭翁湯后證實，其正丁醇提取物 (Butyl alcohol extract of BaiTouWeng，BAEB)對體外白念珠菌具有明顯抑制作用，對VVC模型小鼠也具有很好治療作用。VVC的發(fā)病除了白念珠菌本身的毒力因子如黏附、酵母—菌絲相轉(zhuǎn)化、生物被膜形成、外分泌水解酶產(chǎn)生等之外，機體能否積極調(diào)動免疫力來對真菌抗感染也至關(guān)重要。目前認(rèn)為，固有免疫在阻止真菌病的發(fā)生上比適應(yīng)性免疫更加重要，前者主要包括屏障作用、吞噬作用以及正常體液中的抗菌物質(zhì)。近年來發(fā)現(xiàn)，作為固有免疫重要組成的炎癥小體 (inflammsome )在真菌等病原體感染中發(fā)揮重要作用。本文擬研究BAEB如何從炎癥小體角度發(fā)揮其抗VVC作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌SC5314由第二軍醫(yī)大學(xué)姜遠(yuǎn)英教授惠贈。

藥物 白頭翁湯 (白頭翁15 g、黃柏12 g、黃連6 g、秦皮15 g)購買于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院并經(jīng)鑒定，參照張夢翔等[3]方法制備白頭翁湯正丁醇提取物。氟康唑膠囊購買于廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H20059399。

動物 清潔級雌性昆明種小鼠72只 (20±2.0) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

試劑 FastQuant RT Kit (with gDNase)試劑盒 (北京天根生物有限公司)，IL-1β、IL-18的ELSIA試劑盒 (南京森貝伽生物有限公司)；Trizol試劑盒 (invitrogen公司)；cDNA第一條鏈合成試劑盒 (北京天根生物有限公司)；SYBR○RGreen試劑盒 (QIAGEN公司)。

儀器 DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科技有限公司)，BH2顯微鏡 (OLYMPUS)，TS-12A生物組織自動脫水機、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 (江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)，HM325切片機 (Thermo)，BM-1X生物組織包埋機 (孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，Spectra Max M2e多功能酶標(biāo)儀 (美谷分子儀器有限公司)，Eppendorf 5417R高速冷凍離心機 (德國Eppendorf公司)；ABI普通PCR儀 (美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)ABI 7000熒光定量PCR儀 (美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)。

1.2 方法

菌液配制 在沙氏平板上無菌挑取白念珠菌菌落，接種至液體沙氏培養(yǎng)基中，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，離心，棄上清，將濃度調(diào)成3×106CFU/mL使用。

實驗分組 將72只雌性昆明種小鼠隨機分為6組，每組12只，分為正常組、VVC模型組、氟康唑治療組、BAEB治療組 (20 mg·kg-1,40 mg·kg-1,80 mg·kg-1)，除了正常組之外其他組都要先建立VVC模型。

VVC小鼠模型建立[4]首先將每只小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mg，每隔1 d注射1次，一共注射3次。第6天后，用無菌蒸餾水對小鼠陰道進(jìn)行灌洗，然后對灌洗液進(jìn)行涂片，染色，觀察是否有小鼠陰道上皮細(xì)胞，若有上皮脫落，將準(zhǔn)備好的白念珠菌菌液 (3×106CFU/mL)，每只10 μL接種小鼠陰道內(nèi)，接種后將小鼠倒立3 min以防止菌液流出，同樣操作持續(xù)接種3 d。

藥物治療及效果觀察 在VVC模型復(fù)制成功1 d后，對小鼠進(jìn)行治療。其中氟康唑組每日用20 mg·kg-1劑量的氟康唑進(jìn)行灌胃，每天1次；BAEB治療組分別用 (20,40,80) mg·kg-1BAEB進(jìn)行灌胃，每天1次，連續(xù)治療1周。采用30 μL的生理鹽水對小鼠陰道進(jìn)行灌洗，取20 μL灌洗液經(jīng)稀釋后涂布于平板上。37℃培養(yǎng)1天后觀察并計數(shù)平板上白念珠菌菌落的數(shù)量，然后計算出陰道內(nèi)白念珠菌載荷量。

HE染色觀察組織小鼠陰道組織病理學(xué) 取小鼠陰道組織浸泡于10%甲醛溶液中1周，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片厚度為4 μm，HE染色后，顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變情況。

ELISA檢測小鼠陰道IL-1β、IL-18含量 取組織于勻漿器中，加入1 mL無菌水勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液待測，按照ELISA試劑盒操作測定組織中IL-1β、IL-18的含量。

qRT-PCR檢測組織TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA相對變化 采用TRZOL按照說明書依次提取各組組織mRNA，取5 μL RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行第一條鏈合成，采用SYBR熒光染料法，反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR，PCR Primer各1 μL，模板0.5 μL，ddH2O 10 μL。在ABI7000熒光擴(kuò)增，PCR體系為95℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增定量程序為40個循環(huán)：變性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 45 s；內(nèi)參基因選用GAPDH，實驗重復(fù)3次。所有引物委托上海生工合成引物，引物情況見表1。

表1 各引物序列表

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 BAEB對各組小鼠陰道組織形態(tài)學(xué)改善

與正常組 (見圖1A)相比，模型組小鼠陰道黏膜層完全破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤 (見圖1B)。與模型組比較，BAEB組呈現(xiàn)出不同程度的改善，其中，BAEB高劑量組炎癥浸潤較少，中、低劑量組存在輕度炎癥浸潤 (見圖1C、1D、1E)。氟康唑組小鼠陰道黏膜炎癥浸潤較少 (見圖1F)。

2.2 BAEB對VVC小鼠陰道真菌載荷量的影響

與正常組小鼠比較，VVC模型組小鼠陰道灌洗液中白念珠菌載荷量 (CFU/mL)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)(見圖2)。藥物治療后，與模型組比較，BAEB高劑量、中劑量、低劑量、氟康唑組小鼠真菌載荷量均有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001)，其中BAEB高劑量組、氟康唑組下降較為顯著 (見圖2)。

2.3 BAEB對VVC小鼠陰道組織中IL-1β、IL-18的影響

與正常組相比較，模型組小鼠陰道組織中IL-1β、IL-18含量均顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001，見圖3)。BAEB治療后，高劑量組、中劑量組、低劑量組、氟康唑組的IL-1β、IL-18含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001，見圖3)，其中高劑量組最明顯。

2.4 BAEB對VVC小鼠陰道組織中TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)的影響

與正常組相比較，模型組小鼠TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表達(dá)分別上調(diào)了6.26、6.50、4.81、3.07、4.12倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001，見圖4)。與模型組比較，BAEB高劑量組TLR2、TLR4、NLRP3、caspase-1的mRNA分別上調(diào)了3.56、3.47、2.53、3.02，中劑量對于上述基因上調(diào)倍數(shù)分別為4.13、5.12、2.99、3.47，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)。此外，高劑量組對于ASC基因上調(diào)2.57，其中BAEB低劑量對于NLRP3基因的表達(dá)相比于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001)。

3 討 論

鑒于固有免疫在真菌感染中的重要作用，而炎癥小體是近年來發(fā)現(xiàn)的固有免疫的一個重要組成，且在外陰陰道念珠菌病 (VVC)中發(fā)現(xiàn)存在過度激活現(xiàn)象，故本研究試圖從炎癥小體角度探討白頭翁湯正丁醇提取物 (BAEB)對VVC的治療作用。

炎癥小體 (inflammasome)是一類由胞漿內(nèi)模式識別受體 (Pattern recognition receptors，PRRs)參與組裝的多蛋白復(fù)合體，能夠識別病原體病原體相關(guān)分子模式 (Pathogen associated mole-cular patter,PAMPs)或者宿主來源的危險信號分子 (Damage associated molecular patterns,DAMPs)。NLR蛋白如NLRP1、NLRP3、NLRC4以及非NLR家族成員如AIM2以及Pyrin均能形成炎癥小體并具有較明確的生理功能。NLRP3是目前研究最多的一種炎癥小體[5]。

圖1各組小鼠陰道組織形態(tài)學(xué)改變 (HE，200×)：A.正常組,B.模型組,C.BAEB高劑量組,D.BAEB中劑量組,E.BAEB低劑量組,F.氟康唑組圖2各組小鼠陰道灌洗液中白念珠菌載荷量 (與正常組相比較，###P<0.001，與模型組相比較，***P<0.001)圖3各組小鼠陰道組織勻漿中IL-1β、IL-18的含量 (與正常組相比較，###P<0.001，與模型組相比較，**P<0.01,***P<0.001)圖4各組小鼠TLR2、TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA變化倍數(shù) (與正常組相比較，###P<0.001；與模型組相比，***P<0.05,**P<0.001)

Fig.1Morphological changes of vaginal tissue in each group (HE staining,200×)Fig.2The CFUs ofCandidaalbicansin vaginal lavage fluid of each groupFig.3The levels of IL-1β and IL-18 in the vaginal tissue homogenate of each groupFig.4The expressions of TLR2,TLR4,NLRP3,ASC and caspase-1 in each group

NLRP3炎癥小體由識別分子NLRP3、接頭分子ASC以及效應(yīng)分子半胱天冬酶1 (capase-1)組成。NLRP3炎癥小體具有多種激活劑，可以被真菌、細(xì)菌、病毒等病原體PAMP，以及ATP、尿酸晶體、β淀粉樣纖維等DAMP所激活[6-7]。

真菌感染時，真菌表面的葡聚糖、甘露聚糖等PAMP識別免疫細(xì)胞TLRs并活化NF-κB，后者上調(diào)NLRP3、IL-1β和IL-18前體的表達(dá)。NLRP3再進(jìn)一步進(jìn)行自身寡聚化，并招募接頭分子ASC，后者招募并使caspase-1前體自身剪切活化，活化的caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子，引起宿主炎癥反應(yīng)[4-5]。

研究表明，VVC時由于NLRP3炎癥小體過度激活會造成了IL-1β和IL-18大量產(chǎn)生以及陰道內(nèi)中性粒細(xì)胞的大量招募，從而引起陰道黏膜的損傷[8-10]。因此，鑒于NLRP3炎癥小體在VVC中過度活化所造成的致病性作用，NLRP3炎癥小體被視作藥物干預(yù)VVC的一個潛在的靶標(biāo)。

本實驗結(jié)果顯示，VVC模型組小鼠陰道內(nèi)真菌載荷量呈現(xiàn)出高水平，組織勻漿中IL-1β、IL-18呈現(xiàn)高表達(dá)，組織形態(tài)學(xué)顯示出大量炎癥細(xì)胞浸潤，與黃月娜等[11]的研究結(jié)果基本一致。BAEB治療7 d后，小鼠陰道真菌載荷量均有不同程度降低，陰道組織病理有不同程度的改善，IL-β、IL-18的含量也有顯著降低。進(jìn)一步的qRT-PCR結(jié)果顯示，VVC模型組小鼠陰道組織的TLR2、TLR4的mRNA呈現(xiàn)出高表達(dá)水平，而BAEB治療后TLR2、TLR4的轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的降低，尤其以BAEB高劑量最為顯著。另外，針對NLRP3炎癥小體的組成成分，VVC模型組小鼠NLRP3、ASC及caspase-1的基因呈現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄，BAEB高劑量干預(yù)后能夠顯著抑制NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA的表達(dá)。

本研究表明，BAEB對VVC具有顯著療效，同時發(fā)現(xiàn)對NLRP3炎癥小體具有明顯下調(diào)作用。但BAEB如何通過NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗VVC的詳細(xì)機制還有待于進(jìn)一步探討。且由于中藥復(fù)方多成分、多靶點的作用特點，BAEB中諸多的活性成分分別作用于炎癥小體中的哪些具體組分尚有待于進(jìn)一步揭示。

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[3] 張夢翔,夏丹,施高翔,等.白頭翁湯正丁醇提取物對堿性pH條件下白念珠菌VVC臨床株形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響[J].中國中藥雜志,2015,40(4):710-715.

[4] 夏丹,張夢翔,施高翔等.白頭翁湯抑制小鼠陰道念珠菌的增殖并降低炎性細(xì)胞因子水平[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜質(zhì),2016,32(2):153-157.

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