王丹，鄭涌泉，趙良才，鄭宏，高紅昌，張華杰

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 藥劑科，浙江杭州 310006）

核磁共振氫譜檢測(cè)糖尿病不同發(fā)病階段額葉和枕葉的代謝變化

王丹1，鄭涌泉2，趙良才1，鄭宏1，高紅昌1，張華杰1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 藥劑科，浙江杭州 310006）

目的:運(yùn)用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)方法分析1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個(gè)腦區(qū)的代謝變化。方法:取正常大鼠（n=22）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)病1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）的額葉和枕葉組織進(jìn)行1H NMR檢測(cè)，并結(jié)合多元模式識(shí)別和代謝物定量分析闡述代謝特征。結(jié)果:糖尿病發(fā)病各個(gè)時(shí)期，額葉和枕葉的代謝模式均發(fā)生顯著改變。與正常大鼠相比，代謝物乳酸（Lac）、?；撬幔═au）、肌醇（m-Ins）含量隨著糖尿病的發(fā)展明顯升高；而N-乙酰天冬氨酸（NAA）、天冬氨酸（Asp）、琥珀酸（Suc）等的含量顯著降低。結(jié)論:額葉和枕葉的代謝變化相似，且均發(fā)生于糖尿病早期，主要涉及能量代謝紊亂、谷氨酸-谷氨酰胺-γ-氨基丁酸（Glu-Gln-GABA）循環(huán)抑制、滲透壓調(diào)節(jié)增強(qiáng)。

糖尿病；能量代謝；額葉；枕葉；核磁共振氫譜；大鼠

糖尿病引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷日益受到關(guān)注[1]。糖尿病會(huì)導(dǎo)致腦萎縮和白質(zhì)損傷，臨床上，腦萎縮和白質(zhì)損傷通常被認(rèn)為是糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)[2]。而糖尿病患者腦內(nèi)額葉和枕葉萎縮與注意力下降和記憶力損傷密切相關(guān)[3]。然而，導(dǎo)致糖尿病腦損傷的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。

基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域擁有重要地位和強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)[4-8]。本研究利用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學(xué)方法分析1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個(gè)腦區(qū)的代謝變化，找出具有時(shí)間依賴性和腦區(qū)特異性的特征代謝物和代謝途徑，為闡明糖尿病患者注意力和記憶力發(fā)生障礙的潛在發(fā)病機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物 Bruker AVANCE I I I 600核磁共振譜儀（德國(guó)Bruker公司）；血糖試紙及血糖儀（德國(guó)貝朗醫(yī)療國(guó)際貿(mào)易有限公司）；冷凍干燥機(jī)（ALPHA-4，德國(guó)Christ公司）。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；重水（D2O，99.9%）購(gòu)于英國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；檸檬酸、檸檬酸鈉、甲醇、氯仿購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Sprague-Dawley（SD）大鼠44只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 1型糖尿病模型的建立:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，即糖尿病組和對(duì)照組，各22只。大鼠禁食12 h后，糖尿病組腹腔注射STZ檸檬酸鈉混懸溶液（70 mg/kg，現(xiàn)配現(xiàn)用），72 h后測(cè)其血糖水平，空腹血糖值大于16.7 mmol/L的大鼠為造模成功的糖尿病大鼠。對(duì)照組注射同等劑量的檸檬酸鈉混懸溶液（0.1 mol/L，pH=4.5）。

1.2.2 腦組織（額葉和枕葉）樣本的收集和處理:大鼠在STZ誘導(dǎo)1周（n=8）、5周（n=7）、9周（n=7）后斷頭處死，快速分離出額葉和枕葉，并將收集的腦組織樣本迅速浸入液氮中急凍，置于-80 ℃保存。冰凍的腦組織樣本稱重后，置于勻漿管中，加入冰甲醇4 mL/g，蒸餾水0.85 mL/g，使用手持式組織勻漿機(jī)勻漿，渦漩15 s；再加入2 mL/g氯仿，渦漩；最后分別加入2 mL/g冰氯仿和冰蒸餾水，渦漩后于冰上靜置15 min。于1 000×g 4 ℃條件下離心15 min，取上層水溶性代謝物。凍干24 h，得到代謝物粉末。最后將粉末重新溶解于500 μL D2O中，離心（12 000×g，10 min，4 ℃），上清液轉(zhuǎn)入NMR樣品管中進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 腦組織提取物的1H NMR檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理:于600 MHz NMR波譜儀上進(jìn)行NMR采集實(shí)驗(yàn)，探頭溫度控制為25 ℃，累加采樣256次，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，譜寬為12 000 Hz，弛豫延遲10 s。將采得的時(shí)域信號(hào)進(jìn)行傅立葉變換后，使用Topspin 2.1軟件對(duì)所有的1H NMR譜圖進(jìn)行相位校正、基線調(diào)整，并以乳酸的甲基峰的化學(xué)位移（1.33 ppm）定標(biāo)[9]。所有譜圖用MATLAB軟件（R2012a，美國(guó)MathWorks公司）進(jìn)行對(duì)齊處理[10]。將1H NMR譜從δ0.1～10.0 ppm按0.01 ppm為單位進(jìn)行自動(dòng)分段積分，為了消除預(yù)飽和壓水峰時(shí)引起的譜線扭曲，將δ5.16～4.70 ppm的水峰區(qū)域設(shè)為0積分段。對(duì)每一段積分值都相對(duì)于該譜的所有積分值進(jìn)行歸一化，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+12.0軟件（瑞典Umetrics公司）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）。所得得分圖是以第一和第二主成分作為x，y坐標(biāo)軸構(gòu)建的二維空間，該空間中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，圖中橢圓區(qū)域代表95%的置信區(qū)間。由PLS-DA得到的軌跡圖中，一個(gè)點(diǎn)代表各組某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的代謝輪廓。相應(yīng)的彩色相關(guān)系數(shù)載荷圖（correlation coefficient color-coded loadings plot）上，橫坐標(biāo)代表化學(xué)位移，縱坐標(biāo)代表相關(guān)系數(shù)|r|值（0～1.0），表示各代謝物對(duì)組間分離的貢獻(xiàn)，|r|越大，即圖中峰顏色越偏向于暖色調(diào)，對(duì)組間分離的貢獻(xiàn)越大。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病發(fā)病不同時(shí)期的額葉和枕葉1H NMR譜及代謝模式分析 腦組織提取物的1H NMR波譜可以同時(shí)測(cè)量多種內(nèi)源性代謝物，圖1和圖2分別為額葉和枕葉提取物的典型1D1H NMR譜，基于實(shí)驗(yàn)室前期已發(fā)表的研究成果[6，11]及2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗(yàn)證，歸屬代謝物有乳酸（Lac，δ1.33，δ4.11）、丙氨酸（Ala，δ1.47）、N-乙酰天冬氨酸（NAA，δ2.01，δ4.39），γ-氨基丁酸（GABA，δ1.90，δ2.29）、谷氨酸（Glu，δ2.35，δ3.75）、琥珀酸（Suc，δ2.40）、谷氨酰胺（Gln，δ2.45，δ3.75）、天冬氨酸（Asp，δ2.82）、肌酸（Cre，δ3.03，δ3.93）、膽堿（Cho，δ3.20）、牛磺酸（Tau，δ3.42）、甘氨酸（Gly，δ3.55）和肌醇（m-Ins，δ3.52，δ4.06）。從代謝軌跡圖中可以看出額葉和枕葉2個(gè)腦區(qū)，糖尿病組和對(duì)照組在第一主成分方向上明顯區(qū)分，且糖尿病發(fā)展這一因素對(duì)代謝模式的影響遠(yuǎn)大于大鼠自身生長(zhǎng)發(fā)育這一因素對(duì)代謝模式的影響，見(jiàn)圖3A和4A。且2個(gè)腦區(qū)在糖尿病發(fā)病不同時(shí)期的代謝模式均明顯區(qū)分，見(jiàn)圖3B和4B。在額葉區(qū)，引起糖尿病組和對(duì)照組之間的差異的主要代謝物有:Lac、NAA、Gln、m-Ins；同樣的，這些也是引起枕葉區(qū)代謝差異的主要特征性代謝物，見(jiàn)圖3C和4C。

圖1 對(duì)照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時(shí)大鼠額葉組織典型的1H NMR譜

圖2 對(duì)照組1周（A）和糖尿病組1周（B）、5周（C）、9周（D）時(shí)大鼠枕葉組織典型的1H NMR譜

2.2 代謝物定量分析結(jié)果 進(jìn)一步對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析后發(fā)現(xiàn)，在糖尿病組1周時(shí)的大鼠額葉中，NAA、GABA、Gln、Cho含量明顯下降，m-Ins含量顯著升高，而枕葉中還存在Lac升高的現(xiàn)象。當(dāng)糖尿病發(fā)展至5周時(shí)，在之前的基礎(chǔ)上，代謝變化逐漸加劇，額葉中的Lac開(kāi)始顯著升高，枕葉中的Tau顯著升高。至第9周時(shí)，代謝變化持續(xù)加劇，Asp開(kāi)始在2個(gè)腦區(qū)顯著降低，此外，額葉中的Tau開(kāi)始出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，枕葉中的Gly開(kāi)始出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

2.3 Glu-Gln-GABA循環(huán) 糖尿病1周時(shí)，額葉和枕葉區(qū)均已開(kāi)始出現(xiàn)Glu、Gln、GABA含量減少的趨勢(shì)。與對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組大鼠額葉和枕葉區(qū)，三者總含量（Glu+Gln+GABA）在1、5、9周時(shí)均持續(xù)降低，見(jiàn)圖5。

3 討論

圖3 額葉模式識(shí)別分析結(jié)果

圖4 枕葉模式識(shí)別分析結(jié)果

3.1 能量代謝紊亂 腦部能量需求至少占人體總能量需求的20%[12]，腦能量代謝紊亂與腦病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病的發(fā)病進(jìn)程中，額葉和枕葉中Lac含量均持續(xù)升高，而Lac在腦內(nèi)是由能量底物葡萄糖通過(guò)無(wú)氧酵解方式代謝產(chǎn)生的，在糖尿病大鼠腦內(nèi)的這種異常升高，說(shuō)明無(wú)氧酵解途徑增強(qiáng)。同時(shí)，當(dāng)糖尿病發(fā)展到第9周時(shí)，2個(gè)腦區(qū)中三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）中間產(chǎn)物Asp和Suc均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，說(shuō)明TCA循環(huán)活性減弱，可能是高糖刺激腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞致使其線粒體受損，從而影響到正常的氧化呼吸供能。綜上所述，糖尿病誘導(dǎo)的無(wú)氧酵解過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致無(wú)效供能增加，而發(fā)病后期TCA循環(huán)的減弱，進(jìn)一步加劇了能量代謝紊亂。

3.2 神經(jīng)元-膠質(zhì)代謝區(qū)間改變 哺乳動(dòng)物腦內(nèi)存在2個(gè)主要代謝區(qū)間，分別是神經(jīng)元代謝區(qū)間和膠質(zhì)細(xì)胞代謝區(qū)間[6]，Glu-Gln-GABA循環(huán)在維持這2個(gè)代謝區(qū)間的神經(jīng)遞質(zhì)平衡以及大腦運(yùn)作中起著至關(guān)重要的作用[10]。Glu被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取后，在膠質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化為Gln，因?yàn)楣劝滨０泛铣擅竷H存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，隨后合成的Gln被轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元，作為氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu和GABA的主要前體物質(zhì)，繼續(xù)參與神經(jīng)沖動(dòng)傳遞或其他代謝途徑。本研究在2個(gè)腦區(qū)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)Glu、Gln、GABA的含量有持續(xù)減少的趨勢(shì)，三者總含量隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展顯著降低，說(shuō)明在糖尿病發(fā)病進(jìn)程中，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間的這一重要循環(huán)受到阻礙，遞質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡被打破。這一結(jié)果與本課題組早前在2型糖尿病模型db/db小鼠海馬內(nèi)得到的Glu-Gln循環(huán)減弱的結(jié)果[7]一致?？梢?jiàn)無(wú)論是1型還是2型糖尿病，高血糖造成的腦中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間的遞質(zhì)傳遞障礙普遍存在。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，從糖尿病1周開(kāi)始，額葉和枕葉區(qū)就已開(kāi)始出現(xiàn)Glu-Gln-GABA循環(huán)障礙的現(xiàn)象，且隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展持續(xù)減弱。有研究[3]表明糖代謝紊亂的早期就已觸發(fā)腦損傷，這種代謝水平觀測(cè)到的早期代謝異常，很可能是導(dǎo)致糖尿病患者逐漸發(fā)展演變?yōu)槟X損傷的重要原因。

表1 糖尿病組大鼠腦中代謝物含量變化表

3.3 氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂 m-Ins、Tau是反映膠質(zhì)細(xì)胞增生或膠質(zhì)細(xì)胞活性以及膠質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)的特征性代謝物，主要參與調(diào)節(jié)滲透壓平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14-15]。糖尿病1周大鼠額葉和枕葉中m-Ins的增加以及糖尿病發(fā)病后期Tau的升高表明2個(gè)腦區(qū)中膠質(zhì)細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)的需求增強(qiáng)。Cre的含量在2個(gè)腦區(qū)中一直維持穩(wěn)定，這也與相關(guān)文獻(xiàn)[16-18]報(bào)道的腦內(nèi)Cre含量在絕大多數(shù)疾病發(fā)生時(shí)一般恒定不變是相符的。此外，與對(duì)照組大鼠相比，額葉和枕葉中NAA從1周時(shí)開(kāi)始顯著降低，與1型糖尿病患者額葉活體定域MRS結(jié)果[19-20]一致。而NAA作為神經(jīng)元活性的特征性代謝物，其含量的降低說(shuō)明神經(jīng)元受損。結(jié)合上述分析，神經(jīng)元受損可能是導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間的Glu-Gln-GABA循環(huán)障礙的重要誘因。

3.4 腦區(qū)相似性 本實(shí)驗(yàn)分別考察了大腦內(nèi)參與調(diào)節(jié)注意力和記憶力的2個(gè)腦區(qū)—額葉和枕葉，在糖尿病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的一系列重要的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的擾動(dòng)。值得一提的是，在糖尿病發(fā)病進(jìn)程中，2個(gè)腦區(qū)中發(fā)生變化的特征性代謝物基本一致，且隨著發(fā)病周期的增加具有規(guī)律性的持續(xù)降低或升高，比如Lac、NAA、m-Ins、Suc、Asp、Tau、Gly等。說(shuō)明高血糖對(duì)額葉和枕葉造成的代謝紊亂是相似的，只是個(gè)別代謝物的擾動(dòng)發(fā)生的時(shí)期略有差異，比如Lac的升高在額葉中至第5周才出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在枕葉中第1周就顯著升高；額葉中的Tau在糖尿病造模9周后才出現(xiàn)明顯升高，而枕葉中發(fā)病第5周就具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說(shuō)明雖然額葉和枕葉在大腦內(nèi)分布的具體位置不同，但是可能由于它們均參與調(diào)控注意力和記憶力，功能上相互協(xié)調(diào)，所以一旦受到外界刺激，會(huì)引起相似的代謝調(diào)控反應(yīng)，這也進(jìn)一步說(shuō)明了高血糖可能會(huì)對(duì)注意力和記憶力造成損害，而且，這種損害在糖尿病發(fā)病早期（1周）時(shí)，就已經(jīng)可以觀測(cè)到代謝水平的擾動(dòng)。

圖5 糖尿病大鼠額葉和枕葉中Glu、Gln和GABA總含量柱狀圖

綜上所述，本研究應(yīng)用基于1H NMR的代謝組學(xué)方法分析了1型糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉2個(gè)腦區(qū)的代謝水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血糖對(duì)額葉和枕葉在糖尿病各個(gè)時(shí)期的代謝輪廓均造成了較大程度的影響。從代謝物水平觀測(cè)到2個(gè)腦區(qū)中發(fā)生的特征性代謝物變化具有相似性，且多數(shù)代謝紊亂在糖尿病發(fā)病早期就已開(kāi)始出現(xiàn)，隨著糖尿病的發(fā)生發(fā)展逐漸加劇，其中包括能量代謝出現(xiàn)紊亂、Glu-Gln-GABA循環(huán)受到抑制、滲透壓調(diào)節(jié)的增強(qiáng)等。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Study on frontal lobe and occipital lobe metabolism in different stages of diabetes using1H NMR spectros-

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WANG Dan1, ZHENG Yongquan2, ZHAO Liangcai1, ZHENG Hong1, GAO Hongchang1, ZHANG Huajie1.

1.School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Department of Pharmacy, Women’s Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310006

Objective：To investigate the metabolic changes of frontal lobe and occipital lobe in different stages of diabetes.Methods：The frontal lobe and occipital lobe were dissected from the 1-week, 5-week and 9-week diabetic rats and the age-matched controls.1H NMR-based metabonomics combined with multivariate pattern recognition analysis and quantitative analysis were used to study the metabolic characteristics.Results：The metabolic patterns of frontal lobe and occipital lobe were signif cantly changed in different stages of diabetes. Compared to the controls, lactate, taurine and myo-inositol were distinctly increased both in frontal lobe and occipital lobe with the development of diabetes, while the levels of N-acetyl-aspartate, aspartate and succinate were markedly decreased.Conclusion：The metabolic changes in frontal lobe and occipital lobe are similar, and occurr in the early stage of diabetes. The metabolic changes mainly focus around the disordered energy metabolism, inhibit Glu-Gln-GABA cycle and increas osmoregulation.

diabetes mellitus; energy metabolism; frontal lobe; occipital lobe;1H NMR; rats

R34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.003

2016-05-17

浙江省藥學(xué)重中之重一級(jí)學(xué)科開(kāi)放基金（YKFJ2-003）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14H090014，LY15H180010）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金新教師類資助課題（20133321 120006）。

王丹（1991-），女，浙江嘉興人，碩士生。

張華杰，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:zhanghuajie116@ sina.com。