譚立明 張玉紅 陳娟娟 李 華 肖揚(yáng)婧卿 吳 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330006)

小細(xì)胞性肺癌患者檢測抗紡錘體抗體和抗著絲點(diǎn)抗體的臨床意義①

譚立明 張玉紅②陳娟娟 李 華 肖揚(yáng)婧卿②吳 洋 曾婷婷 田永建 余建林

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330006)

目的：研究抗紡錘體(MSA)和抗著絲點(diǎn)(ACA)抗體檢測對診斷小細(xì)胞性肺癌(SCLC)的臨床價(jià)值，為SCLC的分子研究提供臨床依據(jù)。方法：對93例SCLC患者和208例非小細(xì)胞性肺癌(NO-SCLC)患者及50例健康體檢者，用酶聯(lián)免疫法定量檢測MSA抗體，間接免疫熒光法定性檢測MSA、ACA和抗核抗體(ANA)，并對其結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果：①IIF法檢測SCLC組MSA和ACA陽性率為36.56%和30.11%，均高于其他腫瘤組(P<0.01)。②相關(guān)性分析，MSA與SCLC的RR值高達(dá)12.93、12.74，ACA和ANA與SCLC的RR值為4.31和3.48。③MSA檢測SCLC的ROC曲線下面積AUC為0.778，診斷價(jià)值中等。 結(jié)論：MSA和ACA對SCLC有很強(qiáng)正相關(guān)危險(xiǎn)因素，可能參與SCLC的發(fā)生發(fā)展，對SCLC的早期檢測、臨床診斷及潛在的治療方法有一定的應(yīng)用價(jià)值。

小細(xì)胞型肺癌；抗紡錘體抗體；抗著絲點(diǎn)抗體；抗核抗體

小細(xì)胞型肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)是我國乃至全球癌癥死亡的主要原因，占肺癌的10%～15%[1]。SCLC分化極差、侵襲性強(qiáng)、生長迅速，常發(fā)展到晚期才出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，早診斷、早治療是關(guān)鍵。目前的診斷方法有病理學(xué)、影像學(xué)、血清學(xué)等檢測方法，對SCLC診斷率均不高、特異性不強(qiáng)[2]，SCLC有一特點(diǎn)——早期就發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，理論上利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高[3]，通過腫瘤自身抗體檢測對提高SCLC的診斷率、生存率意義更大。筆者在臨床檢測中發(fā)現(xiàn)，在SCLC患者血清中MSA和ACA陽性率明顯高于其他腫瘤患者，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 腫瘤患者均為2011年12月～2013年12月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診及住院確診病例，SCLC患者93例(男69例、女24例，30～82歲，平均62歲)，肺腺癌(Lung adenocarcinoma carcinoma，LAC)62例(男48例、女14例，42～77歲，平均64歲)，肺鱗癌(Lung squamous carcinoma，LSC)52例(男39例、女13例，40～81歲，平均65歲)，胃癌(Gastric cancer，GC)27例(男18例、女9例，45～71歲，平均56歲)，肝癌(Hepatocellular carcinoma，HC)29例(男20例、女9例，39～75歲，平均59歲)，大腸癌(Intestinal cancer，IC)22例(男14例、女8例，44～69歲，平均58歲)，鼻咽癌(Nasopharynx cancer，NC)16例(男11例、女5例，39～71歲，平均57歲)；健康對照50例均來自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者(男31例、女19例，27～65歲，平均55歲)。所有入選者自愿接受實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書。

1.1.2 診斷依據(jù) SCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)參考美國NCCN小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南[4]。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合所有條件者予以納入：①知情、自愿參與；②診斷明確，臨床、影像學(xué)、病理組織學(xué)資料完整；③對入選患者的資料重新評估，否定合并其他自身免疫性疾病及合并其他癌癥；④健康對照組者血常規(guī)、血壓、血糖、血脂、胸片、心電圖及肝膽胰檢查無異常。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 以下情況者予以剔除：①腫瘤分型不明確或非原發(fā)性腫瘤；②合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎臟等系統(tǒng)疾病，甲狀腺疾病、糖尿?。虎廴焉锘虿溉槠趮D女；④不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 空腹采靜脈不抗凝血3.0 ml左右，2 500 r/min離心15 min分離血清，-20℃冷凍待檢，避免反復(fù)凍融。

1.2.2 間接免疫熒光法 檢測MSA、ACA和ANA抗體。試劑由德國歐蒙公司生產(chǎn)，MSA抗體采用歐蒙實(shí)驗(yàn)室提供的全新Hep-20-10細(xì)胞株，ACA和ANA采用Hep-2細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆?。?biāo)本按試劑要求稀釋，取25 μl于玻片上，覆上生物膜片，室溫孵育30 min，洗去游離標(biāo)本，用洗液浸泡5 min，瀝干加20 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記二抗，避光室溫孵育30 min，沖去游離二抗，用洗液浸泡5 min，瀝干后用甘油封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.3 ELISA法 檢測MSA抗體。試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，在包被紡錘體抗原的聚丙乙烯孔中，樣本孔加入稀釋液40 μl、血清10 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，空白孔不加樣本和酶，37℃溫箱孵育30 min，洗液洗板5次，加辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的紡錘體抗原50 μl，37℃溫箱孵育30 min，洗板5次，加底物和顯色劑顯色各50 μl，37℃溫箱孵育10 min，加終止液，用450nm波長比色，計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 評價(jià)指標(biāo) 根據(jù)經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診的患者體內(nèi)抗體檢測結(jié)果來計(jì)算自身抗體的臨床評價(jià)指標(biāo)：敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比、準(zhǔn)確性和約登指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)描述。①組間單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。②MSA與SCLC相關(guān)性用相對危險(xiǎn)度(Relative risk,RR)及RR的顯著性χ2確定，RR>1,正關(guān)聯(lián)危險(xiǎn)因素；RR<1,保護(hù)因素。③抗體間優(yōu)勢分析采用配對χ2檢驗(yàn)，一致性分析計(jì)算Kappa值(P<0.01)。④對定量資料作受試者特征曲線(Receiver operating characteristic,ROC),計(jì)算ROC曲線下面積(Area under the curve,AUC)。

2 結(jié)果

2.1 MSA、ACA、ANA與SCLC相關(guān)性分析 SCLC患者血清MSA、ACA抗體檢測陽性率與其他癌癥患者比較，經(jīng)χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析RR值顯示MSA為SCLC關(guān)聯(lián)很強(qiáng)的正相關(guān)危險(xiǎn)因素，ACA、ANA為關(guān)聯(lián)強(qiáng)的正相關(guān)危險(xiǎn)因素，結(jié)果見表1。

2.2 SCLC與其他腫瘤組檢測自身抗體結(jié)果(間接免疫熒光法) SCLC組MSA、ACA和ANA陽性率為36.56%、30.11%和24.73%，MSA和ACA與其他組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2檢測，均P<0.01，結(jié)果見表2。

表1 兩種檢測方法對SCLC及其他癌癥患者血清MSA抗體檢測結(jié)果[n(%)]

Tab.1 MSA detection in patients with SCLC and other types of cancer by two methods[n(%)]

GroupsnELISAMSAMSAIIFACAANASCLC9339(41.94)34(36.56)28(30.11)23(24.73)NO-SCLC20811(5.29)9(4.33)7(3.37)19(9.13)RR12.9312.744.313.48χ262.3154.5311.3814.58P<0.01<0.01<0.01<0.01

Note：RR value:Highly strongly relative (≥10.0),strongly relative(3.0-9.0),intermediately relative (1.5-2.9).

表2 SCLC及其他癌癥患者自身抗體檢測結(jié)果[n(%)]

Tab.2 Results of autoantibodies in SCLC and other cancer groups[n(%)]

Note：vs SCLC,1)P<0.01;2)P<0.05.

表3 SCLC中各項(xiàng)臨床評價(jià)指標(biāo)結(jié)果

Tab.3 Clinical evaluation parameters in SCLC

GroupSensib-ility(%)Specif-icity(%)Likelihoodratio(+)Likelihoodratio(-)Availab-ility(%)YoudenindexMSA36.5695.197.600.6777.080.32ACA30.1196.638.930.7276.080.27ANA24.7389.902.450.8469.770.15

表4 SCLC組抗體間優(yōu)勢分析(P)和一致性分析Kappa (κ)

Tab.4 Advantage analysis(P) and consistency analysis [Kappa(κ)] between antibodies in SCLC group

GroupMSA&ACAMSA&ANAACA&ANAP0.3270.0520.383K(P<0.01)0.3740.3280.435

Note：Kappa(κ):0.4-0.6 as moderate consistency,0.6-0.8 as high consistency,>0.8 as great consistency.

2.3 SCLC患者M(jìn)SA、ACA和ANA抗體檢測的各項(xiàng)臨床評價(jià)指標(biāo)(免疫熒光法) MSA對檢測SCLC的準(zhǔn)確性最高為77.6%，MSA和ACA特異性高達(dá)95.19%和96.63%，結(jié)果見表3。

2.4 SCLC患者M(jìn)SA、ACA和ANA抗體間優(yōu)勢分析(P)和一致性分析Kappa (κ)(免疫熒光法) 一致性分析顯示在SCLC中MSA與ACA、ANA一致性較差；優(yōu)勢分析顯示三者對診斷SCLC均無明顯差異。見表4。

2.5 MSA對診斷SCLC準(zhǔn)確性評估作ROC曲線 MSA的 AUC(P<0.01)為0.778，診斷價(jià)值中等。見圖1。

3 討論

SCLC 目前缺乏有效的早期診斷及治療方法，治療后復(fù)發(fā)率高，5年生存率僅為6.4%[2]。SCLC是來自肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、惡性程度最高的一種肺癌，一些罕見的屬于自身免疫性疾病的神經(jīng)系統(tǒng)副腫瘤綜合征與SCLC高度相關(guān)。研究表明，在一些沒有自身免疫性疾病的早期SCLC患者或在未來發(fā)展為SCLC患者體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)多種自身抗體[5,6]，雖然滴度不高，但這足以說明自身免疫反應(yīng)影響著SCLC的發(fā)生發(fā)展，這些免疫反應(yīng)可能是SCLC的一個(gè)窗口期反應(yīng)，在機(jī)體發(fā)展為SCLC之前免疫系統(tǒng)就表現(xiàn)出癥狀，這提示可以通過檢測這些自身免疫性標(biāo)志物(Marker)來為SCLC的早期診斷及預(yù)測提供途徑。如果在未發(fā)展為SCLC時(shí)就加以干涉，或早期發(fā)現(xiàn)SCLC并加以正確治療，將有希望增高SCLC的診斷率和生存率，并為改進(jìn)SCLC的臨床治療方法提供方向。

導(dǎo)致肺癌的主要危險(xiǎn)因素是吸煙、工作環(huán)境及遺傳，研究表明肺部有害物質(zhì)的長期接觸可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷和破壞紡錘體，危險(xiǎn)因素暴露的細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂中期，在此過程中可產(chǎn)生兩個(gè)以上子細(xì)胞或發(fā)生細(xì)胞融合——非整倍體細(xì)胞生成，這與中心體數(shù)目異常有關(guān)[7，8]。中心體是微管的主要組織中心，它分裂分離成紡錘體的兩極，中心體數(shù)目受紡錘體功能的調(diào)控，細(xì)胞分裂中期，所有染色體的著絲點(diǎn)位于赤道面上，染色體分離就依靠附著于著絲點(diǎn)上的紡錘體微管完成[9]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中紡錘體相關(guān)蛋白基因出現(xiàn)異?？杀憩F(xiàn)為紡錘體相關(guān)蛋白過度表達(dá)[10]，過度表達(dá)的相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，機(jī)體免疫耐受增高引起自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生自身抗體，這似乎與本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果有奇妙的聯(lián)系，IIF法檢測SCLC組MSA和ACA陽性率為36.56%和30.11%，均高于其他腫瘤組，經(jīng)χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明免疫系統(tǒng)針對紡錘體及著絲點(diǎn)為抗原所引發(fā)的免疫反應(yīng)在一定程度上影響著SCLC的發(fā)生發(fā)展過程，此結(jié)論有理可據(jù)，筆者將實(shí)驗(yàn)結(jié)果作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩法檢測MSA與SCLC的RR值分別高達(dá)12.93和12.74，ACA和ANA與SCLC的RR值為4.31和3.48，MSA為SCLC關(guān)聯(lián)很強(qiáng)的正相關(guān)危險(xiǎn)因素，ACA、ANA為關(guān)聯(lián)強(qiáng)的正相關(guān)危險(xiǎn)因素，對SCLC的早期診斷有臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前，關(guān)于腫瘤的自身免疫反應(yīng)的研究尚不成熟，SCLC體內(nèi)能檢測到多種自身抗體，但抗紡錘體抗體的研究未見報(bào)道，本研究選擇Hep-20-10細(xì)胞基質(zhì)檢測MSA抗體，采用IIF法檢測發(fā)現(xiàn)，Hep-20-10細(xì)胞株具有多于Hep-2數(shù)十倍的分裂期細(xì)胞。與常規(guī)方法相比，利用HEp-20-10細(xì)胞更容易辨別分裂期細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)(著絲點(diǎn)、紡錘體纖維、中間體、中心粒和核仁形成區(qū))抗體。MSA對診斷SCLC的特異性為95.19%，準(zhǔn)確性高達(dá)77.08%，陽性率為36.56%明顯高于其他腫瘤組，經(jīng)χ2檢測，均P<0.01，有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用ELISA法定量檢測MSA，并做MSA診斷SCLC的ROC曲線，ACU為0.778，診斷價(jià)值中等，當(dāng)然任何一種腫瘤并不簡單，幾乎都不能用單一某種標(biāo)志物做出診斷。染色體分裂靠紡錘絲牽拉著絲點(diǎn)，本研究發(fā)現(xiàn)抗著絲點(diǎn)抗體ACA對診斷SCLC的特異性高達(dá)96.63%，準(zhǔn)確性為76.08%，SCLC組ACA陽性率為30.11%，與肺腺癌、肺鱗癌等其他癌癥相比，經(jīng)χ2檢測，均P<0.01，差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明細(xì)胞受紡錘體及著絲點(diǎn)等影響而導(dǎo)致分裂異常可能是SCLC的發(fā)病機(jī)制之一，然而具體的抗原蛋白定位有待進(jìn)一步研究，有希望在早期甚至預(yù)測為SCLC時(shí)就采取措施，阻斷其發(fā)展通路，提高診斷率和降低死亡率。

MSA、ACA陽性率在SCLC中較其他腫瘤優(yōu)勢明顯，細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的紡錘絲與著絲點(diǎn)相連接，牽拉著絲點(diǎn)使姐妹染色體分離，本研究一致性分析顯示在SCLC中MSA與ACA一致性較差，這說明在SCLC中MSA及ACA并非簡單地以紡錘體及著絲點(diǎn)為抗原而產(chǎn)生的自身抗體。自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生是由于免疫系統(tǒng)不能識別自身抗原，腫瘤細(xì)胞自身異?？僧a(chǎn)生抗原，但許多抗原并非腫瘤細(xì)胞所特有，還有一種是機(jī)體腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中相關(guān)蛋白異常而產(chǎn)生的抗原。紡錘體及著絲點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞分裂機(jī)制復(fù)雜，導(dǎo)致分裂異常的抗原蛋白可能有多種，途徑也多樣，MSA和ACA抗體的產(chǎn)生機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，這對研究SCLC的治療方法也存在一定價(jià)值。ANA的靶抗原包括細(xì)胞核和細(xì)胞漿等整個(gè)細(xì)胞，ANA陽性可出現(xiàn)在許多疾病中，特異性較差，不能確定任何疾病，在本研究中發(fā)現(xiàn)SCLC組ANA陽性率為24.73%，與肺腺癌、肺鱗癌相比，經(jīng)χ2檢測，均P<0.05，差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖相比其他癌癥并無明顯優(yōu)勢，但對肺癌鑒別還是存在一定的價(jià)值。

綜上所述，MSA和ACA是SCLC很強(qiáng)的正相關(guān)危險(xiǎn)因素，可能參與SCLC的發(fā)生發(fā)展，對SCLC的早期檢測、臨床診斷及潛在的治療應(yīng)用存有一定價(jià)值。

[1] Oberg K,Hellman P,Kwekkeboom D,etal.Neuroendocrine bronchial and thymic tumours:ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis,treatment and follow-up[J].Ann Oncol,2010,21(5):220-222.

[2] Kazarian M,Laird-Offringa IA.Small-cell lung cancer-associated autoantibodies:potential applications to cancer diagnosis,early detection,and therapy[J].Mol Cancer,2011,10(33):33.

[3] Smith RA,Cokkinides V,Eyre HJ.American Cancer Society guidelines for the early detection of cancer[J].CA Cancer J Clin,2006,56(1):11-25.

[4] Kalemkerian GP,Akerley W，Bogner P，etal.Small cell lung cancer:clinical practice guidelines in oncology[J].J Natl Compr Canc Netw,2013,11(1):78-98.

[5] Titulaer MJ,Klooster R,Potman M,etal.SOX antibodies in small-cell lung cancer and Lambert-Eaton myasthenic syndrome:frequency and relation with survival[J].J Clin Oncol,2009,27:4260-4267.

[6] Ducray F,Graus F,Vigliani MC,etal.Delayed onset of a second paraneoplastic neurological syndrome in eight patients[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2010,81:937-939.

[7] Masuda A,Maeno K,Nakagawa T,etal.Association between mitotic spindle checkpoint impairment and susceptibility to the induction of apoptosis by anti-microtubule agents in human lung cancers[J].Am J Pathol,2003,163(3):1109-1116.

[8] Beatriz de A C,Gonzalo Q,Alfredo C,etal.The fate of chrysotile-induced multipolar mitosis and aneuploid population in cultured lung cancer cells[J].PLoS One,2011,6(4):18600-18613.

[9] Glotzer M.The 3Ms of central spindle assembly:microtubules,motors and MAPs[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(1):9-20.

[10] Du J,Du Q,Zhang Y,etal.Expression of cell-cycle regulatory proteins BUBR1,MAD2,Aurora A,cyclin A and cyclin E in invasive ductal breast carcinomas[J].Histol Histopathol,2011,26(6):761-768.

[收稿2016-06-14]

(編輯 倪 鵬)

Clinical significance of anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody detected in patients with small cell lung cancer (SCLC)

TANLi-Ming,ZHANGYu-Hong,CHENJuan-Juan，LIHua，XIAOYang-Jing-Qing，WUYang，ZENGTing-Ting，TIANYong-Jian，YUJian-Lin.

DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang330006,China

Objective:To detect anti-mitotic spindle apparatus antibody (MSA) and anti-centromere antibody (ACA) and explore the clinical value for the diagnosis of small cell lung cancer (SCLC),providing clinical evidence for molecular studies of SCLC.Methods: 93 SCLC patients,208 non-small cell lung cancer (non-SCLC) patients and 50 healthy controls were enrolled in this study.MSA antibodies were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).MSA,ACA and anti nuclear antibodies (ANA) were examined by indirect immuno-fluorescence (IIF).And the results were retrospectively analyzed.Results: ① The positivity for MSA and ACA by IIF assay was respectively 36.56% and 30.11% in SCLC group,higher than other tumor groups (P<0.01).② In correlative analysis,the RR value between MSA and SCLC was as high as 12.93,12.74,and the RR value of ACA and ANA with SCLC was respectively 4.31 and 3.48.③the area under ROC (Receiver operating characteristic) curve (AUC) of MSA detection for SCLC was 0.778,with medium diagnostic value.Conclusion: MSA and ACA for SCLC are highly strong positive correlation risk factors,and may participate in the occurrence and development of SCLC,moreover,have some application value for early detection,clinical diagnosis and potential treatments of SCLC.

Small cell lung cancer;Human mitotic spindle apparatus antibodies;Anti-centromere antibodies;Antinuclear antibodies

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.021

譚立明(1963年-)，男，教授，主任技師，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫病的病因及抗體檢測等相關(guān)性研究，E-mail：yuuje@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)03-0418-04

①本文為江西省科技廳社發(fā)項(xiàng)目(No.2015BBG70154)、江西省科技廳重點(diǎn)科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化計(jì)劃(No.20151BBI90047)和江西省衛(wèi)生廳科研計(jì)劃支持項(xiàng)目(No.20133075、20151072)。

②南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌330006。