李濤，張慎貴，趙文博，宋巖，王新立，于永慧，孫晉浩，王洪杰

(1濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，濟(jì)南250031；2山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院；4山東省立醫(yī)院)

放射性腦損傷是指對(duì)腦部或腦鄰近部位實(shí)施放射治療后引起的腦組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，放療患者經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙[1]和情緒異常，如焦慮、抑郁等，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[2]。目前，對(duì)放射性腦損傷導(dǎo)致情緒變化的原因尚不明確。2016年1～6月，我們采用8 Gy照射劑量建立放射性腦損傷小鼠模型，采用開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的情緒變化，并觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化，探討放射性腦損傷對(duì)情緒的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 4～6周齡C57BL/6J雄性小鼠24只，購(gòu)于山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室。將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、照射組各12只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序通過(guò)了山東大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，遵守照顧和維護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的法律授權(quán)和國(guó)家的指導(dǎo)方針。

1.2 照射方法 照射組進(jìn)行頭部電子線照射建立放射性腦損傷模型。使用Elekta Precise直線加速器，20 cm×20 cm電子線限光筒，制作1 cm厚度鉛模，照射野大小2.0 cm×1.5 cm，使照射野上界位于小鼠雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，以保護(hù)雙眼、鼻腔及口腔。照射前使用4%水合氯醛腹腔注射后，俯臥位固定于自制圓形木板上，使小鼠腦部與限光筒鉛模射野一致。給予6 MeV電子線、400 mu/min劑量率、源皮距100 cm、8 Gy的組織吸收劑量行一次性照射，建立放射性腦損傷模型。對(duì)照組麻醉后放在相似的環(huán)境中，但不進(jìn)行照射。

1.3 焦慮反應(yīng)評(píng)價(jià) 采用開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮反應(yīng)。所有小鼠于照射后第7天行開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。使用活動(dòng)觀察箱大小為40 cm×40 cm×40 cm，底面等分為25個(gè)格子，依次將每只小鼠輕放于箱中，使用自發(fā)活動(dòng)分析軟件分析10 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)情況。將中央3/5的區(qū)域定義為中央?yún)^(qū)域，記錄小鼠中央?yún)^(qū)域的活動(dòng)路程及活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)次數(shù)、10 min內(nèi)糞便數(shù)量。

1.4 抑郁反應(yīng)評(píng)價(jià) 開場(chǎng)試驗(yàn)后，小鼠休息2 h，行懸尾試驗(yàn)。在懸尾實(shí)驗(yàn)操作箱頂部中心繩連有一個(gè)小書夾，夾住裹有小鼠尾尖(尾巴末端0.5～1 cm)的膠布并使之倒懸，小鼠頭部距離底部4～5 cm。總時(shí)間為6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間。懸尾不動(dòng)判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠四肢完全不動(dòng)或僅有足部輕度掙扎動(dòng)作。

1.5 海馬組織病理觀察 照射后第7天行開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后，將小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，先用生理鹽水 100 mL 快速?zèng)_洗，隨后用PBS液200 mL先快后慢進(jìn)行灌注，灌注后30 min取腦，放入10%甲醛溶液中固定，12 h后取材、脫水、包埋、切片、烤片、染色、封片。顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 兩組焦慮反應(yīng)指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，照射組中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間增加，活動(dòng)次數(shù)、10 min內(nèi)糞便數(shù)量均減少(P<0.05或0.01)。兩組活動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)活動(dòng)路程差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組焦慮反應(yīng)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.2 兩組抑郁反應(yīng)指標(biāo)比較 對(duì)照組、照射組懸尾不動(dòng)時(shí)間分別為(52.00±7.61)、(74.16±13.35)s，照射組懸尾不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)。

2.3 兩組海馬組織病理表現(xiàn) 對(duì)照組海馬各部位結(jié)構(gòu)及層次清楚，細(xì)胞形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻。照射組海馬神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡變性、核固縮，染色不均勻。見圖1。

3 討論

放射治療是治療鼻咽癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、轉(zhuǎn)移瘤等頭頸部腫瘤的主要方法之一，隨著立體定向放療、三維適形調(diào)強(qiáng)放療等放療技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤患者的生存時(shí)間不斷延長(zhǎng)，但放療所導(dǎo)致的放射性腦損傷越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。急性放射性腦損傷多數(shù)發(fā)生在照射后很短時(shí)間內(nèi)，一般為1～7 d，主要由放射線對(duì)腦組織的直接損傷作用、血腦屏障受損、通透性增加等所致的腦水腫導(dǎo)致[3,4]。研究表明，單次照射劑量>3 Gy及照射野體積過(guò)大均可以導(dǎo)致急性放射性腦損傷的發(fā)生[5]。放射性腦損傷患者的常見臨床癥狀包括頭痛、肢體活動(dòng)障礙、認(rèn)知功能障礙和情緒改變等。情緒改變是放射性腦損傷后常出現(xiàn)的癥狀之一。范興文等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腦部照射1個(gè)月后可導(dǎo)致大鼠活動(dòng)度降低、焦慮水平增加。但目前，對(duì)于急性放射性腦損傷后的情緒障礙尚待深入研究。

注：A為對(duì)照組；B為照射組。

圖1 兩組小鼠海馬組織病理表現(xiàn)(HE染色，×100)

開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)焦慮行為的常用方法之一[7]。因動(dòng)物在敞箱中會(huì)對(duì)新鮮環(huán)境產(chǎn)生恐懼，主要在敞箱內(nèi)的周邊部活動(dòng)，中央?yún)^(qū)域?qū)ζ鋪?lái)說(shuō)具有潛在的威脅，故而在中央?yún)^(qū)活動(dòng)較少，從而可以反映其焦慮水平變化。開場(chǎng)試驗(yàn)中動(dòng)物排便數(shù)量通常作為一個(gè)測(cè)量動(dòng)物焦慮行為的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，照射組中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)次數(shù)、10 min內(nèi)糞便數(shù)量均減少，表明小鼠在放射性腦損傷后急性期焦慮水平升高。小鼠懸尾試驗(yàn)是最常用的監(jiān)測(cè)動(dòng)物抑郁行為的實(shí)驗(yàn)，以一定時(shí)間內(nèi)小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間來(lái)反映其絕望情緒。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，照射組小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表明放射性腦損傷急性期小鼠抑郁水平明顯升高。

海馬在學(xué)習(xí)記憶和情緒調(diào)節(jié)中都起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，海馬對(duì)射線具有高度敏感性，射線照射后，海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少、突觸密度明顯降低，并呈現(xiàn)放射劑量依賴性，這種變化可以持續(xù)至少1個(gè)月[8]。研究證明，顱內(nèi)照射海馬齒狀回區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞后可導(dǎo)致一些神經(jīng)心理缺陷，其原因可能與照射后海馬神經(jīng)減少、血腦屏障破壞、突觸密度降低、脫髓鞘等有關(guān)[9～11]。射線照射后損傷加重的機(jī)制可能與神經(jīng)興奮性毒性、炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮老化等有關(guān)[12～14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，X線照射能抑制海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并通過(guò)激活胱天蛋白酶-1誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，使用胱天蛋白酶-1抑制劑阻斷體內(nèi)和體外胱天蛋白酶-1激活后，神經(jīng)干細(xì)胞凋亡減少[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，照射組海馬神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)空泡變性、細(xì)胞核固縮，提示照射后可使小鼠海馬組織變性壞死，放射性腦損傷急性期出現(xiàn)的焦慮抑郁水平升高可能與海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)。

綜上所述，放射性腦損傷可導(dǎo)致小鼠焦慮及抑郁水平升高、活動(dòng)度減低，其原因可能與海馬神經(jīng)元受損有關(guān)。