葉賢勝+赫軍+張佳琳+龐曉斌+張蕾+喬灝祎+潘雪格+張佳+劉淑娜+張維庫+續(xù)潔琨

[摘要] 利用各種色譜技術(shù)對山茱萸的化學(xué)成分進行研究，從山茱萸水提取物中分離得到6個化合物，分別為6′-O-乙?；?7α-O-乙基莫諾苷（1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），芹菜素（3），cirsiumaldehyde（4），對香豆酸（5），咖啡酸（6），其中化合物1為新化合物，化合物2～4為首次從山茱萸屬植物中分離得到。利用MTT 法檢測了化合物2～6對缺氧缺糖損傷的PC12細胞的保護作用，結(jié)果表明化合物4在1.0 μmol·L^-1的濃度下，對OGD/R損傷的PC12細胞物有一定的保護作用。

[關(guān)鍵詞] 山茱萸；化學(xué)成分；6′-O-乙酰基-7α-O-乙基莫諾苷；PC12細胞

[Abstract] To investigate the chemical compounds from the fruit of Cornus officinalis，six compounds were isolated and determined by extensive spectroscopic analysis as 6′-O-acetyl-7α-O-ethyl morroniside （1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），apigenin （3），cirsiumaldehyde（4）， p-coumaric acid （5），caffeic acid （6）. Compound 1 was a new iridoid glucoside，and compounds 2-4 were obtained from the Cornus genus for the first time. Compounds 2-6 were evaluated for the viability of PC12 cells when exposed in conditions of oxygen and glucose deprivation. The MTT results showed that compound 4 increased cell viability moderately in OGD/R treated PC12 cells at the concentration of 1.0 μmol·L^-1.

[Key words] Cornus officinalis；chemical constituents；6′-O-acetyl-7α-O-ethyl morroniside；PC12 cells

doi：10.4268/cjcmm20162419

山茱萸為山茱萸科Cornaceae植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，主產(chǎn)于山西、陜西、河南等省[1]，是我國傳統(tǒng)的名貴滋補中藥材。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性酸、澀，微溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補益肝腎和澀精固脫之功效[2]。研究表明山茱萸的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜、鞣質(zhì)、黃酮、三萜和苯丙素類等[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明山茱萸在降血糖，降血脂，抗炎、抑菌，抗心律失常，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤，抗血栓等方面均表現(xiàn)出較好的活性[3，6-9]。目前關(guān)于山茱萸的化學(xué)成分研究還不夠深入，為了更好的闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗對山茱萸的化學(xué)成分進行了系統(tǒng)地研究，采用硅膠柱色譜、ODS柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和制備高效液相色譜等方法分離純化得到6個化合物，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)分別鑒定為6′-O-乙?；?7α-O-乙基莫諾苷（1），（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside（2），芹菜素（3），cirsiumaldehyde（4），對香豆酸（5），咖啡酸（6）。其中化合物1為新化合物（圖1），化合物2～4為首次從山茱萸屬植物中分離得到。此外，還利用MTT法檢測了化合物2～6對缺氧缺糖損傷的PC12細胞的保護作用，結(jié)果表明在化合物4在1.0 μmol·L^-1的濃度下，對OGD/R損傷的PC12細胞物有一定的保護作用。

1 材料

JASCO P-2000 Polarimeter型旋光儀（JASCO公司）；Nicolet 5700型FT-IR紅外光譜儀（Thermo Fisher公司）；Bruker AV-400/600型核磁共振儀（BrukerBiospin公司）；Agilent 1200 LC/MSD TOF型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司）；Agilent 1100型分析液相（DAD檢測器）；Waters制備液相（泵：Waters 515型，檢測器：Waters 2487）；島津制備液相（泵：LC-20AR，檢測器：SPD-20A）；WFH-203三用紫外分析儀；Sartorius-BS223S電子分析天平；D101型大孔吸附樹脂為滄州寶恩吸附材料科技有限公司生產(chǎn)；柱層析硅膠（100～200目，200～300目）為青島海洋化工廠生產(chǎn)；硅膠GF254薄層預(yù)制板為煙臺化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品；ODS（30～50 μm）為YMC公司生產(chǎn)；Sephadex LH-20型凝膠為Pharmacia公司生產(chǎn)；制備型HPLC色譜柱為ES Epic C₁₈色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）和ES Sonoma C₁₈色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）；實驗所用試劑均為分析純（北京化工廠）和色譜純（Honeywell）。

實驗所用山茱萸為2013年11月采摘自陜西省佛坪縣，由北京中醫(yī)藥大學(xué)續(xù)潔琨副教授鑒定為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸C. officinalis的成熟果實，樣本存放于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所（No.20131106）。

2 提取分離

干燥的山茱萸果實（63 kg），水煎煮提取2次（600，500 L），每次2 h。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏（約28.9 kg）。總浸膏用水混懸后經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱，依次用水，30%，55%，95%乙醇洗脫。30%乙醇洗脫部位濃縮后得浸膏2.8 kg，經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇（100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A～Fr.E。

Fr. A經(jīng)硅膠柱色譜分離，氯仿-丙酮（100∶0，95∶5，9∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A1～Fr.A4；Fr.A1經(jīng)硅膠柱色譜分離，環(huán)己烷-乙酸乙酯（100∶0，9∶1，8∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1）梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr. A1-1～Fr. A1-8，其中Fr. A1-6經(jīng)ODS柱色譜分離，依次用10%，18%，25%，33%，40%，50%，65%，85%，100%甲醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr. A1-6-1～Fr. A1-6-8；Fr. A1-6-4在甲醇中結(jié)晶得到化合物4（24 mg）。Fr. A2經(jīng)ODS柱色譜分離，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%甲醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A2-1～Fr.A2-6，其中Fr.A2-1經(jīng)制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相30%甲醇；流速4.0 mL·min^-1）得到化合物6（18 mg）；Fr.A2-2經(jīng)制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相18%乙腈；流速4.5 mL·min^-1）得到化合物5（20 mg）；Fr. A2-4經(jīng)制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相15%甲醇；流速3.5 mL·min^-1）得到化合物3（10 mg）。Fr.A3經(jīng)ODS柱色譜分離，依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，75%甲醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.A3-1～Fr.A3-4，其中Fr.A3-2經(jīng)制備液相分離（色譜柱ES Epic C₁₈；流動相30%乙腈，流速4.5 mL·min^-1）得到化合物1（2 mg）。Fr.B經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜分離，得組分Fr.B1和Fr.B2；Fr.B2經(jīng)ODS柱色譜分離，依次用5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%甲醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同組分，得組分Fr.B2-1～Fr.B2-6，其中Fr.B2-3再經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）柱色譜分離，得8個組分（Fr.B2-3-1～Fr.B2-3-8）；Fr.B2-3-2經(jīng)制備液相分離（色譜柱ES Sonoma C₁₈；流動相33%甲醇；流速5.0 mL·min^-1）得到化合物2（5 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末。[α] 25D+20.33 （c 0.03，MeOH）。HR-ESI-MS m/z 499.178 7 [M+Na]+ （計算值為499.178 6），結(jié)合¹H和¹³C-NMR譜確定分子式為C₂₁H₃₂O₁₂，不飽和度為6。IR顯示該化合物含有羥基（3 381 cm^-1）和羰基（1 734 cm^-1）等結(jié)構(gòu)片段。

¹H-NMR （CD₃OD，400 MHz）譜（表1）高場區(qū)顯示3個甲基質(zhì)子信號δ_H1.20 （3H，t，J=7.2 Hz，H-14），1.36 （3H，d，J=7.2 Hz，H-10），δ_H2.09 （3H，s，H-8′ ）；1個甲氧基質(zhì)子信號δ_H3.72 （3H，s，-OCH₃）；低場區(qū)顯示3個縮醛質(zhì)子信號δ_H4.56 （1H，dd，J=10.0，2.4 Hz，H-7），4.80 （1H，d，J=8.0 Hz，H-1′ ），5.76 （1H，d，J=9.2 Hz，H-1）；1個連氧烯氫質(zhì)子信號δ_H7.53 （1H，s，H-3）；此外，δ_H3.24～4.36為1組葡萄糖特征質(zhì)子信號，葡萄糖端基氫（δ_H4.80）的偶合常數(shù)為8.0 Hz，提示為β型葡萄糖。¹³C-NMR （CD₃OD，100 MHz）譜（表1）共顯示21個碳信號，結(jié)合DEPT譜分別為3個季碳，11個次甲基，3個亞甲基，4個甲基。結(jié)合HSQC譜進一步確定該化合物在高場區(qū)含有3個甲基碳信號δ_C15.6，19.7，20.9；1個亞甲基碳信號δ_C35.9；2個次甲基碳信號δ_C31.9，40.5；1個甲氧基碳信號δ_C51.9；1個連氧亞甲基碳信號δ_C65.4；1個連氧次甲基碳信號δ_C74.0；1組葡萄糖碳信號δ_C75.0 （C-2′），78.0 （C-3′），72.0 （C-4′），75.5 （C-5′），64.8 （C-6′）；在中低場區(qū)顯示3個縮醛碳信號δ_C96.6，100.5，103.0，其中δ_C100.5為葡萄糖的端基碳信號；1個烯碳信號δ_C111.4；1個連氧烯碳信號δ_C154.7；在低場區(qū)顯示1個羰基碳信號δ_C168.8和1個乙酰基碳信號δ_C173.0；結(jié)合以上波譜數(shù)據(jù)，該化合物的NMR數(shù)據(jù)與7α-乙氧基莫諾苷[10]十分相似，不同之處在于該化合物的¹H-NMR譜在δ_H2.09 （3H，s）處多出3個氫信號，¹³C-NMR譜在δ_C173.0和20.9處多出一組乙酰基信號。在HMBC譜（圖2）中H-8′ （δ_H2.09）和H-6′ （δ_H4.32和4.36） 與C-7′ （δ_C173.0）遠程相關(guān)，證明化合物的乙?；Y(jié)構(gòu)片段和葡萄糖結(jié)構(gòu)片段的6′位相連接。在NOESY 譜（圖2）中，H-1與CH₃-10α相關(guān)，H-5β與H-7，H-8，H-9相關(guān)，確定H-1，H-10為α構(gòu)型，H-5，H-7，H-8，H-9為β構(gòu)型。

化合物1 按照文獻[11]方法進行酸水解和衍生化處理，HPLC分析結(jié)果顯示化合物1的糖基部分衍生物與D-葡萄糖標準品的衍生物保留時間一致（t=18.513 min），故確定化合物1的結(jié)構(gòu)中含有D-葡萄糖。

綜合上述分析，化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定為6′-O-乙?；?7α-O-乙基莫諾苷（圖1）。經(jīng)SciFinder系統(tǒng)文獻檢索，發(fā)現(xiàn)該化合物為未經(jīng)報道的新化合物。

化合物 2 白色粉末。¹H-NMR （CD₃OD，400 MHz） δ： 6.75 （1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.70 （1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），6.66 （1H，s，H-8），6.65 （1H，d，J=2.0 Hz，H-6′），6.19 （1H，s，H-5），4.05 （1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），3.85～3.64 （m），3.81 （3H，s，-OCH₃），3.80（3H，s，-OCH₃），3.36-3.23 （m），3.17（1H，m），3.06 （1H，m），2.89 （1H，m，H-1a），2.76 （1H，dd，J=4.0，15.4 Hz，H-1b），1.96 （2H，m，H-2，H-3）；¹³C-NMR （CD₃OD，100 MHz）δ： 149.1 （C-3′），147.4 （C-7），146.2 （C-6），145.4 （C-4′），138.9 （C-1′），133.9 （C-10），129.4 （C-9），123.6 （C-6′），117.5 （C-5），116.1 （C-5′），114.1 （C-2′），112.5 （C-8），104.0 （C-1″），78.4 （C-5″），78.0 （C-3″），75.2 （C-2″），71.5 （C-4″），70.9 （C-3a），65.6 （C-2a），62.6 （C-6″），56.6 （3′-OCH₃），56.5 （7-OCH₃），45.5 （C-3），41.3 （C-2），33.8 （C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對比，故鑒定該化合物為（-）-isolariciresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside。

化合物3 黃色針晶（甲醇）。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 12.95 （1H，s，5-OH），7.91 （2H，d，J=8.8Hz，H-2′，6′），6.92 （2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.76 （1H，s，H-3），6.46 （1H，s，H-8），6.19 （1H，s，H-6）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 181.7 （C-4），164.7 （C-7），163.7（C-2），161.4 （C-4′），161.3 （C-5），157.3 （C-8a），128.4 （C-2′），128.4 （C-6′），121.1 （C-1′），116.0 （C-3′），116.0 （C-5′），103.5 （C-4a），102.8 （C-3），99.0 （C-6），94.0 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13] 對比，故鑒定該化合物為芹菜素（apigenin）。

化合物4 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 9.59 （2H，s，-CHO×2），7.50 （2H，d，J=3.6 Hz，H-3，3′），6.76 （2H，d，J=3.6 Hz，H-4，4′），4.63 （4H，s，H-6，6′）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 178.4 （-CHO×2），157.3 （C-5，5′），152.3 （C-2，2′），123.7 （C-3，3′），112.3 （C-4，4′），63.7 （C-6，6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[14] 對比，故鑒定該化合物為cirsiumaldehyde。

化合物5 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 7.50 （1H，d，J=8.0 Hz，H-7），7.47 （2H，d，J=15.6 Hz，H-3，5），6.78 （2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6），6.28 （1H，d，J=15.6 Hz，H-8）；¹³C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 168.2 （C-9），159.5 （C-4），143.8 （C-7），130.0 （C-2，6），125.3 （C-1），115.7 （C-3，5），114.8 （C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻[15] 對比，故鑒定該化合物為對香豆酸（p-coumaric acid）。

化合物6 淡黃色粉末。¹H-NMR （DMSO-d₆，400 MHz） δ： 7.41 （1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.02 （1H，d，J=2.0Hz，H-2），6.95 （1H，dd，J=2.0，8.4 Hz，H-6），6.75 （1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.17 （1H，d，J=16.0 Hz，H-8）； 13C-NMR （DMSO-d₆，100 MHz） δ： 167.6 （-COOH），147.8 （C-4），145.2 （C-7），144.2 （C-3），125.4 （C-1），120.8 （C-8），115.4 （C-6），114.9 （C-5），114.3 （C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16] 對比，故鑒定該化合物為咖啡酸（caffeic acid）。

4 化合物對PC12細胞缺氧缺糖損傷的保護作用

大鼠嗜鉻瘤PC12細胞用含10%FBS的High-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5%CO₂的培養(yǎng)箱中，隔天換培養(yǎng)液。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部的80%以上時，以0.25%胰蛋白酶消化 2 min后，加入10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，以彎頭滴管輕輕吹下貼壁生長細胞，吹打均勻后分至新細胞培養(yǎng)瓶，加培養(yǎng)液，放入37 ℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中PC12細胞的融合度達到80%以上時，經(jīng)行傳代操作并按照6萬個/mL的密度鋪滿96孔板，100 μL/孔，并分為空白對照組，模型組，陽性藥組，以及化合物組；24 h后依次加入1.0 μmol·L^-1的化合物2～5，陽性藥組加入終濃度為5.0 μmol·L^-1的尼莫地平，空白組與模型組換液處理，放置于細胞培養(yǎng)箱中孵育，作用24 h后，對模型組，陽性藥組，以及各濃度加化合物組加入終濃度為8.0 mmol·L^-1無糖Earles稀釋的Na₂S₂O₄缺氧缺糖損傷45 min，然后各組均加入完全培養(yǎng)基復(fù)氧復(fù)糖4 h；與超凈工作臺中以10 μL/孔加入MTT，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，用多功能酶標儀450 nm下測定各組的A。

實驗結(jié)果顯示，與空白組（100%）相比，模型組細胞存活率（54.1%）明顯降低；與模型組相比，化合物4組細胞存活率從54.1%升高至69.2%，表明化合物4對缺糖缺氧損傷的PC12細胞有一定的保護作用，其他化合物對PC12細胞均無保護作用。

[參考文獻]

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會. 中國植物志 [M]. 北京： 科學(xué)出版社，1990.

[2] 中國藥典. 一部 [S]. 2015： 27.

[3] Cao G，Zhang Y，Cong X D，et al. Research progress on the chemical constituents and pharmacological activities of Fructus Corni[J]. J Chin Pharm Sci，2009，18： 208.

[4] Ma W，Wang K J，Cheng C S，et al. Bioactive compounds from Cornus officinalis fruits and their effects on diabetic nephropathy [J]. J Ethnopharmacol，2014，153： 840.

[5] Lin M H，Liu H K，Huang W J，et al. Evaluation of the potential hypoglycemic and beta-cell protective constituents isolated from Corni Fructus to tackle insulin-dependent diabetes mellitus [J]. J Agric Food Chem，2011，59： 7743.

[6] Park C H，Tanaka T，Yokozawa，et al. Anti-diabetic action of 7-O-galloyl-d-sedoheptulose，a polyphenol from Corni Fructus，through ameliorating inflammation and inflammation related oxidative stress in the pancreas of type 2 diabetics[J]. Biol Pharm Bull，2013，36（5）： 723.

[7] Park C H，Noh J S，Kim J H，et al. Evaluation of morroniside，iridoid glycoside from Corni Fructus，on diabetes-induced alterations such as oxidative stress，inflammation，and apoptosis in the liver of type 2 diabetic db/db Mices[J]. Biol Pharm Bull，2011，34（10）： 1559.

[8] Zhao L H，Ding Y X，Zhang L，et al. Cornel iridoid glycoside improves memory ability and promotes neuronal survival in fimbria-fornix transected rats[J]. Eur J Pharmacol，2010，647： 68.

[9] Zhang Q C，Zhao Y，Bian H M. Anti-thrombotic effect of a novel formula from Corni Fructus with malic acid，succinic acid and citric acid[J]. Phytother Res，2014，28： 722.

[10] 王曉燕，孫磊，喬善義，等. 六味地黃苷糖中糖苷部位的化學(xué)成分研究[J]. 中國中藥雜志，2012，37（17）： 2576.

[11] Tanaka T，Nakashima T，Ueda T，et al. Facile discrimination of aldose enantiomers by reversed-phase HPLC[J]. Chem Pharm Bull，2007，55： 899.

[12] Wen Q W，Lin X，Liu Y Q，et al. Phenolic and lignan glycosides from the butanol extract of Averrhoa carambola L. root [J]. Molecules，2012，17 （10）： 12330.

[13] 任福才，王麗霞，王飛，等. 綿棗兒化學(xué)成分研究 [J]. 中草藥，2014，45 （14）：1984.

[14] 沈杰，楊峻山. 云南山竹子果實的化學(xué)成分研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志，2006，41 （9）： 660.

[15] Fan W Q，Xiong M X，Ma Z，et al. Chemical constituents of Altemanthera philoxeroides[J]. Chin J Nat Med，2008，6 （2）： 112.

[16] 姚士，徐乃玉，褚純雋，等. 藍萼香茶菜的抗補體活性成分研究[J]. 中國中藥雜志，2013，38 （2）：199.

[責(zé)任編輯 丁廣治]