王淑君 趙廣超 欒建鳳 朱培元

不同規(guī)格全血制備富血小板血漿的最佳離心條件研究*

王淑君 趙廣超 欒建鳳 朱培元

目的 研究不同規(guī)格全血分離制備富血小板血漿（PRP）的最佳離心條件。方法 共采集54例健康獻血者的新鮮全血，根據(jù)離心次數(shù)和離心條件分為兩次離心組（A、B、C三種分離方法）和三次離心組（D、E、F三種分離方法）共6組，每組含200、300和400 ml全血各6袋。檢測每組制備PRP的血小板計數(shù)和紅細胞混入量，計算血小板回收率并進行比較。結(jié)果 兩次離心法所制備PRP的血小板回收率最高，但紅細胞混入量較多，其中200 ml全血采用方法A最佳（即初次850 g離心8 min，第2次4 650 g離心5 min），300 ml全血為方法B（初次1 000 g離心6 min，第2次4 650 g離心5 min），400 ml全血為方法C（初次1 220 g離心5 min，第2次4 650 g離心6 min）。三次離心法與二次離心法相比，紅細胞混入量明顯減少（P＜0.05），但血小板回收率有所降低。 結(jié)論 不同規(guī)格全血制備PRP應(yīng)采用不同的離心條件，兩次離心法適用于制備新鮮PRP或血小板膠，而三次離心法更適合冰凍或凍干PRP或血小板膠。

富血小板血漿 無償獻血者 制備

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是將新鮮全血通過特定離心方式得到含高濃度血小板的血漿，可用于制備血小板膠（platelet gel，PG）。PRP與PG富含多種生長因子，在難治性潰瘍、燒傷、口腔醫(yī)學(xué)及整形外科等領(lǐng)域均為研究熱點[1]。絕大部分研究采用患者自體血制備PRP，但由于制備過程需要一定時間，不適合緊急情況下應(yīng)用，同時部分患者不適合采集自體血[2，3]。筆者在采用無償捐獻者全血制備和保存異體PG的研究中發(fā)現(xiàn)，不同規(guī)格的全血分離制備PRP須采用不同的離心條件才能獲得最佳效果，從而滿足不同的使用目的，現(xiàn)報告如下。

對象與方法

1 研究對象 108例健康獻血者（男性68例，女性40例），經(jīng)篩查均符合《獻血者健康要求》（GB18467-2011），征得獻血者知情同意后采集全血。采血過程中充分混勻血液及血液保存液，在規(guī)定時間內(nèi)完成采集（200 、300、400 ml全血的采集時間不超過5、7.5、10 min），采集后6 h內(nèi)離心。共采集200、300、400 ml全血各36袋。2 主要儀器及耗材 Cryofuge 6000i大容量低溫離心機（德國Kendro公司），XE2100全自動血細胞分析儀（日本Sysmex公司），SE250熱合機（韓國森通公司）、CZK-IIC采血秤（蘇州市醫(yī)用儀器廠），一次性使用塑料四聯(lián)采血袋（山東威高）。3 方法

3.1 實驗分組：根據(jù)離心次數(shù)和離心條件分為兩次離心組（A、B、C三種分離方法）和三次離心組（D、E、F三種分離方法），共6組，每組離心分離200、300、400 ml全血各6袋。具體離心條件見表1，離心溫度均為（22±2）℃。詳見表1。

3.2 兩次離心組PRP制備方法：全血經(jīng)初次離心后將上層血漿分入1號轉(zhuǎn)移袋；將另一袋內(nèi)的紅細胞保存液加入主袋的濃縮紅細胞內(nèi)，用熱合機切斷連接塑料管即為懸浮紅細胞；將血漿袋協(xié)同轉(zhuǎn)移袋經(jīng)過第2次離心，使血小板下沉于底部形成沉淀；分離上層少血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）進入2號轉(zhuǎn)移袋，用熱合機切斷塑料管，即為新鮮血漿；充分混勻血小板沉淀與剩余約30 ml血漿（1號轉(zhuǎn)移袋內(nèi)），即為PRP。

3.3 三次離心組PRP制備方法：全血經(jīng)初次離心后將上層血漿分入1號轉(zhuǎn)移袋；將另一袋內(nèi)的紅細胞保存液加入主袋濃縮紅細胞內(nèi)，用熱合機切斷連接塑料管即為懸浮紅細胞；將血漿袋協(xié)同轉(zhuǎn)移袋經(jīng)過第2次離心使紅細胞沉積在底部，分離上層血漿進入2號轉(zhuǎn)移袋，用熱合機切斷分離1號轉(zhuǎn)移袋；將血漿袋協(xié)同轉(zhuǎn)移袋3次離心，使血小板下沉于底部形成沉淀；分離上層PPP進入3號轉(zhuǎn)移袋，用熱合機切斷塑料管即為新鮮血漿（3號轉(zhuǎn)移袋內(nèi)）；充分混勻血小板沉淀與剩余約30 ml血漿（2號轉(zhuǎn)移袋內(nèi)）即為PRP。

3.4 檢測指標：無菌條件下利用10 ml注射器抽取各組PRP 2 ml，測定血小板計數(shù)和紅細胞殘余量，計算血小板回收率（PRP中血小板含量占全血含量的百分率）。

3.5 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS20.0軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，每種規(guī)格全血不同離心方法的PLT回收率、RBC混入量比較采用單因素方差分析的SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

兩次離心法獲得的血小板沉淀中肉眼可見殘留紅細胞，而三次離心法獲得的血小板沉淀中肉眼未見殘留紅細胞。兩次離心法獲得的PRP中血小板含量和血小板回收率均較高，但紅細胞混入量相應(yīng)較高；三次離心法獲得的PRP中血小板含量和血小板回收率雖略有降低，但紅細胞混入量很少。不同規(guī)格全血采用不同離心方法制備的PRP中血小板含量、紅細胞混入量及血小板回收率見表2～4。

討 論

用于制備PG的PRP主要采用手工離心分離法或全自動血液分離機制備，全自動設(shè)備價格昂貴，目前多采用手工分離法。在眾多研究中，采用的離心速度和時間差異很大，終產(chǎn)品的生物特性也不盡相同[4，5]，尚缺乏公認的統(tǒng)一制備標準[6]。此外，多數(shù)有關(guān)PG的研究采用少量全血在試管中制備PRP，制備過程中需多次在試管間轉(zhuǎn)移，獲得的血小板數(shù)量有限。近年來，雖然利用獻血者捐獻的全血制備匯集血小板呈上升趨勢，但大多數(shù)獻血者全血中的血小板并未得到有效利用，在去除白細胞和制備血液成分過程中被丟棄。利用獻血者全血分離制備大量PRP并進行低溫或凍干保存，適用于以下需要采用PG治療的情況：無條件采集自體血的患者，如大面積燒傷或老年體弱者；需反復(fù)治療的患者，如術(shù)后切口不愈合伴竇道形成者；戰(zhàn)場或特殊情況下的嚴重創(chuàng)傷患者。

表1 實驗分組及離心條件

表2 200 ml全血各種離心法的分離效果比較（±s，n=6）

表3 300 ml全血各種離心法的分離效果比較（±s，n=6）

表4 400 ml全血各種離心法的分離效果比較（±s，n=6）

目前，有關(guān)采用獻血者全血制備PRP的最佳離心條件并無一致意見[7，8]。本研究在預(yù)試驗中參考《輸血技術(shù)》（第3版）中制備PRP的條件[9]，即首次以離心力1 220 g離心5 min，再以離心力4 650 g離心6 min（即方法C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)200 ml全血在上述離心條件下形成少量白膜，血小板回收率不足，因此考慮針對不同規(guī)格的全血設(shè)計不同PRP離心制備條件。結(jié)果顯示，通過降低首次離心的離心力，可提高200、300 ml全血的血小板回收率。對于200 ml全血，首次離心采用離心力850 g離心8 min獲得的血小板回收率最高（方法A），300 ml全血首次離心采用離心力1 000 g離心6 min最好（方法B），400 ml全血則維持采用首次1 220 g離心5 min（方法C）。

兩次離心法獲得的PRP中血小板回收率高，但紅細胞混入量相應(yīng)增加，200 ml全血采用方法A、300 ml全血采用方法B、400 ml全血采用方法C獲得的血小板回收率最高。本研究參考文獻報道的血小板分離純化方法[10]，設(shè)計了三次離心法，即在首次離心后增加1次低速離心（213 g，8 min）以進一步去除殘留的紅細胞，結(jié)果紅細胞混入量明顯降低，與兩次離心組的相應(yīng)離心方法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)血小板含量、血小板回收率和紅細胞混入量綜合判斷，200 ml全血采用方法D、300 ml全血采用方法E、400 ml全血采用方法F分離制備的PRP，符合國家標準《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB 18469-2012）中關(guān)于濃縮血小板的質(zhì)量控制要求。

綜上所述，臨床上可根據(jù)PRP的使用目的選擇不同的離心條件：兩次離心法獲得的PRP中血小板回收率最高，但紅細胞混入量較多，適合制備新鮮PRP或PG；三次離心法制備的PRP中血小板有所損失，但紅細胞混入量顯著減少，更適合低溫凍存或凍干保存PRP或PG。

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The Optimal Centrifugation for Preparation of Platelet-rich Plasma from Different Volumes of Whole Blood

WANG Shu-jun，ZHAO Guang-chao，LUAN Jian-feng，et al.
Department of Blood Transfusion，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，PLA，Nanjing 210002

Objective To explore the optimal centrifugation conditions for preparation of platelet-rich plasma（PRP） from different volume of whole blood. Methods Fifty-four bags of freshly collected whole blood from volunteer donors were divided into 6 groups according to centrifugal steps and centrifugal conditions，including 3 two-step（separation method A，B，and C） and three-step centrifugation groups （separation method D，E，and F），with 3 bags of 200 ml，300 ml，and 400 ml whole blood for each group. The platelet count （PLT） and red blood cell count（RBC） of PRP in each group were determined，then PLT recovery was calculated and compared. Results Compared to three-step centrifugation groups，the PRP prepared in two-step centrifugation group had higher PLT recovery and RBC count. The highest PLT recovery in PRP from 200 ml whole blood was prepared by method A （e.g，850×g for 8 min，then 4 650×g for 6min），300 ml whole blood by method B （e.g，1 000×g for 6 min，then 4 650×g for 6 min），and 400ml whole blood by method C （e.g，1 220×g for 5 min，then 4 650×g for 6 min）. The RBC count of PRP in each three-step centrifugation group was decreased significantly （P＜0.05）. Compared with two-step centrifugation group，the PLT recovery in three-step centrifugation group was slightly decreased. Conclusion Different centrifugation conditions should be used for preparation of PRP from different volumes of whole blood . The two-step centrifugation method is suitable for preparation of fresh PG or platelet gel，while the three-step centrifugation method is appropriate for frozen and lyophilized PRP or platelet gel.

Platelet-rich plasma Volunteer donor Preparation

R331.1+43

A

1671-2587（2017）02-0119-04

2016-12-25）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.006

*本課題受全軍重大課題（No.ANJ13J001），南京軍區(qū)醫(yī)院科研基金（No.2015049）資助

21002 江蘇省南京軍區(qū)南京總醫(yī)院輸血科

王淑君（1985–），女，江蘇泰州人，醫(yī)師，碩士，主要從事臨床輸血工作，（Tel）13851928675（E-mail）shujun0106@sina.com。

朱培元，男，江蘇蘇州人，副主任技師，碩士，主要從事臨床輸血研究，（Tel）025-80863323（E-mail）peiyuan.zhu@yahoo.com。