李曉冉，薛耀明

· 論著 ·

醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體FFAR2調(diào)控胰島素分泌機(jī)制的研究

李曉冉1，薛耀明1

目的 探討對(duì)醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體-短鏈脂肪酸受體2（FFAR2）及其配體對(duì)胰島素分泌的影響和相關(guān)機(jī)制。方法 使用以C57BL/6J為背景的野生型（WT）小鼠（n=17）和敲除編碼受體基因Ffar2的轉(zhuǎn)基因（KO）小鼠（n=15），分別于第6周和第26周測(cè)定體重、空腹血糖及胰島素水平。提取小鼠胰島細(xì)胞，隨機(jī)分組分別給予不同濃度葡萄糖和FFAR2配體物質(zhì)（SCA14、SCA15、CPTB和CMTB）刺激，并使用ELISA方法測(cè)定胰島素分泌量。結(jié)果 不同基因型小鼠的體重、空腹血糖及胰島素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。體外胰島β細(xì)胞胰島素分泌實(shí)驗(yàn)中，KO型胰島細(xì)胞在低濃度葡萄糖刺激下胰島素分泌量與WT型無(wú)差別，高濃度葡萄糖刺激下KO型胰島細(xì)胞胰島素分泌量少于WT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。類(lèi)似生理濃度的醋酸鹽（1mM）刺激胰島素分泌，在WT型胰島細(xì)胞中，胰島素分泌量是無(wú)醋酸鹽時(shí)的2倍以上，在KO型胰島細(xì)胞中，促進(jìn)作用減弱。FFAR2配體物質(zhì)SCA14、SCA15在WT型同樣促進(jìn)胰島素分泌，而在KO型胰島細(xì)胞中則無(wú)類(lèi)似作用。另一類(lèi)FFAR2配體物質(zhì)CMTB、CPTB在WT型和KO型胰島細(xì)胞中均抑制胰島素分泌。結(jié)論 敲除Ffar2不影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。FFAR2可調(diào)控胰島素分泌，并具有血糖依賴(lài)性。作為FFAR2的主要配體，醋酸可刺激胰島素分泌且具有受體依賴(lài)性。其他FFAR2配體中，SCA14、SCA15與醋酸作用類(lèi)似，但CPTB和CMTB抑制胰島素分泌且不依賴(lài)受體產(chǎn)生作用。

心血管疾病；糖尿?。籉FAR2；醋酸鹽；小鼠

糖尿病是心血管疾病的重要伴發(fā)疾病，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊叩奶谴x異常率（包括糖尿病及糖尿病前期）約為80%[1]。常用的促胰島素分泌劑通過(guò)K+通道產(chǎn)生作用，由于其非選擇性，關(guān)閉胰島β細(xì)胞上K+通道的同時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)亦起作用，導(dǎo)致不同程度的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[2]。研究表明，醋酸可以影響一系列代謝活動(dòng)，新近發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)醋酸敏感的G蛋白耦聯(lián)受體—短鏈脂肪酸受體2（FFAR2），F(xiàn)FAR2的基因Ffar2在多個(gè)器官中均有發(fā)現(xiàn)，并在人體一系列代謝活動(dòng)中起重要調(diào)控作用[3-6]。然而，醋酸和FFAR2對(duì)胰島素分泌的具體影響仍不明確。為此，本實(shí)驗(yàn)試圖探究包括醋酸在內(nèi)的不同F(xiàn)FAR2配體對(duì)胰島素分泌的影響和其影響是否具有受體依賴(lài)性，為藥物開(kāi)發(fā)尋找新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用以C57BL/6J為背景的人Ffar2雜合子小鼠（Ffar2+/-）獲取Ffar2野生型（WT）及完全敲除編碼受體基因Ffar2的轉(zhuǎn)基因型小鼠（KO），應(yīng)用文獻(xiàn)PCR技術(shù)方法[3]測(cè)定小鼠的基因型。小鼠飼養(yǎng)條件為普通飲食，明暗周期12 h（8：00～20：00），溫度控制在23±2℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 葡萄糖、胰島素測(cè)定ELISA試劑盒（ALPCO）、RNA提取試劑盒及DNase I試劑（Applied Biosystems）、醋酸鈉（Sigma）、丙炔酸（SCA14，Sigma）、丁炔酸（SCA15，Sigma）、CMTB（Tocris Bioscience）、CPTB（Millipore）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad）、血糖儀（ACCU-CHEK Integra型，羅氏）。

1.3 方法

1.3.1 空腹葡萄糖、胰島素測(cè)量及葡萄糖耐量測(cè)定（GTT） 飼養(yǎng)小鼠至第6周、24周時(shí)，實(shí)驗(yàn)前一晚小鼠禁食（20：00～次日8：00），第2 d取尾靜脈血，使用血糖儀檢測(cè)血糖，并使用ELISA方法測(cè)量血胰島素。上述同一批小鼠飼養(yǎng)至第24周，進(jìn)行GTT，實(shí)驗(yàn)前一晚小鼠禁食12 h（20：00～次日8：00），后進(jìn)行腹腔注射糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）。注射葡萄糖劑量為2 g/kg，注射葡萄糖后0、15、30、60、120 min取尾靜脈血，使用血糖儀檢測(cè)血糖。

1.3.2 胰島細(xì)胞分離及培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)[7]方法，使用膠原酶分解并分離小鼠胰島細(xì)胞。主要步驟為通過(guò)胰島管向胰臟注射3 ml膠原酶（濃度為0.8 mg/ml，使用HBSS溶解）。隨后，胰臟被分離，在37℃條件下培養(yǎng)17 min并通過(guò)400 μm的篩孔網(wǎng)過(guò)濾。分解結(jié)束后，使用4℃ HBSS清洗胰島細(xì)胞，并使用密度梯度離心法分離獲得胰島細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)液（RPMI 1640，10%牛血清，1%谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素）中培養(yǎng)過(guò)夜，第2 d用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 體外胰島細(xì)胞胰島素分泌量測(cè)定 分別從WT型及KO型小鼠體內(nèi)提取25個(gè)胰島細(xì)胞（每組重復(fù)4次），在Krebs Ringer緩沖液（130 mM NaCl，4.7 mM KCl，0.5 mM NaH2PO4，0.5 mM MgSO4，1.5mM CaCl2，10mM HEPES，0.1% BSA，pH 7.4）中培養(yǎng)30 min，然后移入葡萄糖濃度為2.8 mM的KRB緩沖液并在37℃培養(yǎng)60 min。隨后在顯微鏡下挑選大小均等的胰島細(xì)胞，以5個(gè)為一組移入1 ml含有葡萄糖和不同刺激物的KRB緩沖液中，在37℃、以45轉(zhuǎn)/min晃動(dòng)速率下培養(yǎng)60 min。葡萄糖濃度包括：2.8 mM、5.6 mM、11.2 mM、16.7 mM，刺激物包括：1 mM醋酸鈉，100μM丙炔酸，100μM丁炔酸，100μM CMTB，100μM CPTB。培養(yǎng)結(jié)束后，取定量的上清液并使用ELISA方法測(cè)定胰島素濃度。

1.3.4 體外胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素總量測(cè)定 分別從WT型及KO型小鼠體內(nèi)提取25個(gè)胰島細(xì)胞（每組重復(fù)4次），移入酸性酒精溶液（70%酒精，0.18 M鹽酸）中，使用超聲裂解細(xì)胞并在4℃下過(guò)夜，第2 d使用ELISA法測(cè)定胰島素含量。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)FFAR2 mRNA的表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明提取RNA，同時(shí)使用DNase I去除DNA污染，用 Super Script II逆轉(zhuǎn)錄酶生成cDNA。FFAR2引物上游序列：5’-GGCTTCTACAGCAGCATCT A-3’，下游：5’-AAGCACACCAGGAAATTAA G-3’；采用β-actin為內(nèi)參照，內(nèi)參引物上游序列：5’-AGGTCATCACTATTGGCAAC-3’，下游：5’-ACTCATCGT- ACTCCTGCTTG-3’。擴(kuò)增程序依據(jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同基因型小鼠體重、血糖及胰島素水平比較 通過(guò)RT-PCR確定KO基因型小鼠的Ffar2表達(dá)相較于WT基因型小鼠顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。飼養(yǎng)KO型小鼠15只、WT型小鼠17只至26周，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。結(jié)果顯示，小鼠體重、空腹血糖及胰島素水平在Ffar2 WT型與KO型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。進(jìn)一步對(duì)各組小鼠進(jìn)行IPGTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，IPGTT在基因型間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖2）。

2.2 不同基因型小鼠體外胰島細(xì)胞的胰島素分泌水平比較 不同基因型小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素總量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3），且均隨著葡萄糖濃度升高胰島素分泌量增加。當(dāng)葡萄糖濃度較低時(shí)（2.8 mM，5.6 mM，11.2 mM），兩種基因型的胰島細(xì)胞所分泌胰島素量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。但在高糖濃度下（16.7 mM），KO型胰島細(xì)胞分泌胰島素量少于WT型胰島細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4A）。

圖1 不同基因型小鼠Ffar2相對(duì)表達(dá)水平比較注：WT：野生型；KO：Ffar2基因敲除型；*P＜0.05

表1 不同基因型小鼠體重、空腹血糖及空腹胰島素水平比較

圖2 不同基因型小鼠IPGTT血糖水平比較注：WT：野生型，n=17；KO：Ffar基因敲除型，n=15；n.s：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖3 不同基因型小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素含量比較注：WT：野生型，n=17；KO：Ffar基因敲除型，n=15；n.s：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖4 不同基因型小鼠體外胰島細(xì)胞胰島素分泌水平比較注：WT：野生型，n=17；KO：Ffar基因敲除型，n=15；*P＜0.05

2.3 不同F(xiàn)FAR2配體物質(zhì)對(duì)胰島素分泌影響的比較 加入類(lèi)似生理濃度的醋酸鹽（1 mM）對(duì)活體外胰島細(xì)胞進(jìn)行刺激后，WT型胰島細(xì)胞的胰島素分泌量是無(wú)醋酸鹽時(shí)的2倍以上，而KO型胰島細(xì)胞的分泌量無(wú)明顯變化（圖4B）。加入其他幾種選擇性FFAR2激動(dòng)劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，羥酸鹽衍生物（SCA，包括SCA14、SCA15）和苯乙酰胺衍生物（包括CPTB和CMTB）。結(jié)果表明，在WT型胰島細(xì)胞中，SCA14、SCA15促進(jìn)胰島素分泌，CPTB和CMTB則相反。在KO型胰島細(xì)胞中，SCA14、SCA15對(duì)胰島素分泌無(wú)明顯影響，而CPTB和CMTB抑制胰島素分泌（圖4C、圖4D）。

3 討論

糖尿病作為心血管疾病的重要伴發(fā)疾病，需得到及時(shí)的診斷和治療[1]。目前，經(jīng)常使用促胰島素分泌劑治療糖尿病，常用的促胰島素分泌劑通過(guò)作用于K+通道產(chǎn)生作用，由于其非選擇性，同時(shí)對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生影響，并導(dǎo)致不同程度的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，尋找新的降血糖藥物具有重要的意義。

一直以來(lái)，民間醫(yī)學(xué)都有運(yùn)用食醋治療疾病的傳統(tǒng)，很多醫(yī)學(xué)研究證實(shí)了食醋的醫(yī)療作用，如可以降低血壓[9,10]、減少脂肪堆積[11]、改善胰島素抵抗[12]等。食醋的主要成分為醋酸[12-14]。在人體血液循環(huán)中有多種短鏈脂肪酸，醋酸是其主要成分，并主要由人體腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生[15]。因此，更多的研究直接作用于醋酸，并證實(shí)了醋酸可以影響一系列代謝活動(dòng)，有助于降低血壓、提高胰島素敏感性、調(diào)節(jié)胰島素分泌等[11,12,16-19]，但其作用機(jī)制尚不明確。

對(duì)醋酸敏感的受體FFAR2的發(fā)現(xiàn)，為醋酸的作用機(jī)制提供了可能的解釋。FFAR2是一種G蛋白耦聯(lián)受體（GPCR），表達(dá)FFAR2的基因Ffar2在包括胰島在內(nèi)的多種器官組織中均有發(fā)現(xiàn)。盡管FFAR2可以被多種短鏈脂肪酸激活，但其對(duì)醋酸鹽的敏感性最高[20]。已有研究證實(shí)，F(xiàn)FAR2在人體一系列代謝活動(dòng)中起重要調(diào)控作用[3-6]。通過(guò)基因表達(dá)及免疫熒光法證實(shí)，胰島β細(xì)胞同樣表達(dá)Ffar2[6,21,22]，在肥胖（ob/ob）和糖尿病（db/ db）小鼠模型中，胰島細(xì)胞中Ffar2的表達(dá)均有上調(diào)[23]。

葡萄糖是胰島細(xì)胞分泌胰島素的主要刺激物，其原理稱(chēng)為葡萄糖依賴(lài)的胰島素分泌（GSIS）。我們研究證實(shí)，F(xiàn)FAR2缺失會(huì)導(dǎo)致高濃度葡萄糖條件下的胰島素分泌功能受損，但在低葡萄糖濃度條件下時(shí)，胰島素分泌功能不受FFAR2影響，說(shuō)明FFAR2可促進(jìn)胰島素分泌并具有血糖依賴(lài)性。作為FFAR2的主要刺激物，生理濃度下醋酸鹽可促進(jìn)胰島素分泌，并部分依賴(lài)FFAR2調(diào)控GSIS功能。但不同F(xiàn)FAR2配體物質(zhì)產(chǎn)生的影響與醋酸鹽并不完全一致，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SCA14、SCA15可促進(jìn)胰島素分泌，并且該作用是FFAR2依賴(lài)性的。而對(duì)于另一類(lèi)配體，CPTB及CMTB則抑制胰島素分泌且不是完全依賴(lài)于FFAR2的。

因此，醋酸可通過(guò)FFAR2對(duì)胰島素分泌產(chǎn)生影響，因?yàn)檫@種促胰島素分泌作用為血糖依賴(lài)性的，減低了低血糖的可能性，同時(shí)由于不通過(guò)K+通道促胰島素分泌，降低了對(duì)心血管風(fēng)險(xiǎn)，這些都揭示了研究成果廣闊的應(yīng)用前景。但同時(shí)FFAR2對(duì)胰島素分泌影響的雙面性顯示了FFAR2介導(dǎo)的分子通路的復(fù)雜性，也說(shuō)明胰島β細(xì)胞內(nèi)的FFAR2通路亟待更多的研究。

[1] 孫健斌,袁寧,柴三葆,等. 口服降糖藥物對(duì)心血管系統(tǒng)的影響[J].中國(guó)老年學(xué),2016,36(10):2548-50.

[2] Schramm TK,Gislason GH,Vaag A,et al. Mortality and cardiovascular risk associated with different insulin secretagogues compared with metformin in type 2 diabetes, with or without a previous myocardial infarction: a nationwide study[J]. Eur Heart J,2011,32(15):1900-8.

[3] Bjursell M,Admyre T,G?ransson M,et al. Improved glucose control and reduced body fat mass in free fatty acid receptor 2-deficient mice fed a high-fat diet[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2011,300(1): E211-20.

[4] Tolhurst G,Heffron H,Lam YS. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via the G-protein-coupled receptor FFAR2[J]. Diabetes,2012,61(2):364-71.

[5] Kimura I,Ozawa K,Inoue D,et al. The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43[J]. Nat Commun,2013,4:1829.

[6] Tang C,Ahmed K,Gille A,et al. Loss of FFA2 and FFA3 increases insulin secretion and improves glucose tolerance in type 2 diabetes[J]. Nat Med,2015,21(2):173-7.

[7] Chen X,Zhang X,Larson CS,et al. In vivo bioluminescence imaging of transplanted islets and early detection of graft rejection[J]. Transplant ation,2006,81(10):1421-7.

[8] Hong YH,Nishimura Y,Hishikawa D,et al. Acetate and propionate short chain fatty acids stimulate adipogenesis via GPCR43[J]. Endocr inology,2005,146(12):5092-9.

[9] Kondo S,Tayama K,Tsukamoto Y,et al. Antihypertensive effects of acetic acid and vinegar on spontaneously hypertensive rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2001,65(12):2690-4.

[10] Sakakibara S,Murakami R,Takahashi M,et al. Vinegar intake enhances flow-mediated vasodilatation via upregulation of endothelial nitric oxide synthase activity[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(5):1055-61.

[11] Kondo T,Kishi M,Fushimi T,et al. Vinegar intake reduces body weight, body fat mass, and serum triglyceride levels in obese Japanese subjects[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(8):1837-43.

[12] Johnston CS,Kim CM,Buller AJ. Vinegar improves insulin sensitivity to a high-carbohydrate meal in subjects with insulin resistance or type 2 diabetes[J]. Diabetes Care,2004,27(1):281-2.

[13] Johnston CS,Steplewska I,Long CA,et al. Examination of the antiglycemic properties of vinegar in healthy adults[J]. Ann Nutr Metab,2010,56(1):74-9.

[14] White AM,Johnston CS. Vinegar ingestion at bedtime moderates waking glucose concentrations in adults with well-controlled type 2 diabetes[J]. Diabetes Care,2007,30(11):2814-5.

[15] Priyadarshini M,Thomas A,Reisetter AC,et al. Maternal short-chain fatty acids are associated with metabolic parameters in mothers and newborns[J]. Transl Res,2014,164(2):153-7.

[16] Shah JH,Wongsurawat N,Aran PP. Effect of ethanol on stimulusinduced insulin secretion and glucose tolerance. A study of mechanisms[J]. Diabetes,1977,26(4):271-7.

[17] Patel DG,Singh SP. Effect of ethanol and its metabolites on glucose mediated insulin release from isolated islets of rats[J]. Metabolism,19 79,28(1):85-9.

[18] Yamashita H,Fujisawa K,Ito E,et al. Improvement of obesity and glucose tolerance by acetate in Type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2007, 71(5):1236-43.

[19] Layden BT,Angueira AR,Brodsky M,et al. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets[J]. Transl Res,2013,161(3):131-40.

[20] Brown AJ,Goldsworthy SM,Barnes AA,et al. The Orphan G proteincoupled receptors GPR41 and GPR43 are activated by propionate and other short chain carboxylic acids[J]. J Biol Chem,2003, 278(13):11312-9.

[21] Layden BT,Durai V,Newman MV,et al. Regulation of pancreatic islet gene expression in mouse islets by pregnancy[J]. J Endocrinol,2010, 207(3):265-79.

[22] Rieck S,White P,Schug J,et al. The transcriptional response of the islet to pregnancy in mice[J]. Mol Endocrinol,2009,23(10):1702-12.

[23] Leonard Z,Bruce MA,Boatman PD. Pat PCT/US2005/039551. WO 2006/052566. . 2006.

本文編輯：姚雪莉

Mechanism of acetate-sensitive G protein-coupled receptor-FFAR2 in regulating insulin secretion

LIXiao-ran*, XUE Yao-ming.*Department of Endocrinology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China.

XUE Yao-ming, E-mail: xueyaoming999@126.com

Objective To investigate the influence of acetate-sensitive G protein-coupled receptor (GPCR)-free fatty acid receptor 2 (FFAR2) its ligands on insulin secretion and relative mechanism. Methods The wild-type (WT) mice with C57BL/6J background (n=17) and Ffar2-knockout (KO) mice (n=15) were chosen, and the levels of weight, fasting blood glucose (FBG) and insulin level were detected on the 6th w and 26th w respectively. The islet cells were collected from mice, and divided randomly into groups. All groups were, respectively, given glucose in different doses and stimulation of FFAR2 ligands (SCA14, SCA15, CPTB and CMTB), and insulin secretion level was detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The difference in weight, FBG and insulin level had no statistical significance in mice with different genotypes (all P＞0.05). In the test of in vitro insulin secretion of pancreatic β cells, insulin secretion level stimulated by low-dose glucose had no difference in KO islet cells and WT islet cells, and that stimulated by high-dose glucose was lower in KO islet cells than that in WT islet cells (P＜0.05). Acetate in the dose similar to physiological dose (1mM) stimulated insulin secretion. The insulin secretion level was 2 times more than that without acetate stimulation in WT islet cells, and this stimulating effect decreased in KO islet cells. SCA14 and SCA15 stimulated insulin secretion in WT islet cells, and had no similar effect in KO islet cells. CPTB and CMTB stimulated insulin secretion in both WT islet cells and KO islet cells. Conclusion The knockout of Ffar2 has no effect on mouse growing development. FFAR2 can regulate insulin secretion and has blood glucose dependency. Acetate, as a main ligand of FFAR2, can stimulate insulin secretion and has receptor dependency. Among other ligands of FFAR2, SCA14 and SCA15 have the similar effect as acetate, and CPTB and CMTB can inhibit insulin secretion and have no receptor dependency.

Cardiovascular diseases; Diabetes; Free fatty acid receptor 2; Acetate; Mice

R587.1

A

1674-4055(2017)03-0293-04

1510515 廣州,南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院內(nèi)分泌科

薛耀明,E-mail:xueyaoming999@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.03.11