李亞巍，梁承武，金瑛，昌盛(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

·基礎(chǔ)研究·

越橘花色苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制

李亞巍，梁承武，金瑛，昌盛
(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

目的 探討越橘花色苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法 雄性KM種小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量[400 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷中劑量[200 mg/(kg·d)]組、越橘花色苷低劑量[100 mg/(kg·d)]組?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d；陽(yáng)性對(duì)照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說(shuō)明給予相應(yīng)劑量藥液，每天定時(shí)灌胃給藥1次。給藥的同時(shí)，除空白對(duì)照組外，其余各組每天皮下注射D-半乳糖(1.25 g/kg)。連續(xù)給藥6周，建立衰老(學(xué)習(xí)記憶障礙)小鼠模型。末次給藥2 h后，進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)訓(xùn)練檢測(cè)各組學(xué)習(xí)記憶能力。測(cè)試完畢，斷頭處死小鼠，采用化學(xué)比色法檢測(cè)小鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫印跡法檢測(cè)小鼠海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)增多，潛伏期縮短，且小鼠海馬組織AChE活性升高，SOD活性降低、MDA含量升高(P均<0.01)；與模型對(duì)照組比較，越橘花色苷各劑量組能夠延長(zhǎng)小鼠跳臺(tái)潛伏期、減少5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)(P均<0.01)，且可以降低小鼠海馬組織AChE活性(P均<0.05)，升高SOD活性,降低MDA含量(P<0.01)；越橘花色苷高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P均﹥0.05。免疫印跡結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.01)。與模型對(duì)照組比較，越橘花色苷中劑量組和高劑量組小鼠cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量下降(P均<0.01)，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.01)。陽(yáng)性對(duì)照組、越橘花色苷高劑量和越橘花色苷中劑量組比較，P均﹥0.05。結(jié)論 越橘花色苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能與改善小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Caspase-3的表達(dá)相關(guān)。

學(xué)習(xí)記憶障礙；衰老；越橘花色苷；D-半乳糖；小鼠

越橘，又稱(chēng)藍(lán)漿果、藍(lán)莓，為杜鵑花科越橘常綠灌木，全世界廣泛分布[1，2]。越橘果實(shí)味道酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，除了含有糖、氨基酸、維生素、膳食纖維等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有豐富的對(duì)人體具有良好保健作用的多酚類(lèi)物質(zhì)——花色苷。據(jù)報(bào)道，越橘是目前花色苷含量最高的水果[3]。越橘花色苷是一種天然的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、促進(jìn)視紅素再合成、延緩衰老等多重功效，且對(duì)人體沒(méi)有任何不良作用[4～6]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)越橘花色苷在諸如抗氧化、清除自由基、抗癌等方面已有詳細(xì)報(bào)道[7，8]，但是，針對(duì)越橘花色苷對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究還非常少。因此，為探討越橘花色苷的益智健腦作用，2015年12月～2016年10月，本研究以D-半乳糖建立衰老(學(xué)習(xí)記憶障礙)小鼠模型，觀察越橘花色苷對(duì)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，并探討其作用機(jī)制，為越橘花色苷的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年KM種小鼠80只，雄性，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-吉2013-0001。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)，室溫18～28 ℃，相對(duì)濕度62%～80%。長(zhǎng)白山野生越橘為8月份采收，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，按參考文獻(xiàn)[9]方法，提取越橘花色苷；腦復(fù)康(吡拉西坦)購(gòu)自吉林雙藥藥業(yè)集團(tuán)有限公司；D-半乳糖購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Caspase-3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruza公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。550型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；UV-4802型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海UNICO儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；MTN-658自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自長(zhǎng)春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司；DT-200型小鼠跳臺(tái)測(cè)試儀購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。

1.2 小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型的建立及分組 首先，將小鼠于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境，然后經(jīng)跳臺(tái)法篩選，即將小鼠置于跳臺(tái)裝置，施以24 V電壓，將過(guò)度敏感小鼠和極不敏感小鼠淘汰，篩選出活躍、對(duì)電擊反應(yīng)敏感、逃避反應(yīng)迅速的合格小鼠60只，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組[吡拉西坦片200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷高劑量組[400 mg/(kg·d)]、越橘花色苷中劑量組[200 mg/(kg·d)]、越橘花色苷低劑量組[100 mg/(kg·d)]，每組10只?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃給予等體積的生理鹽水，1次/d；陽(yáng)性對(duì)照組和越橘花色苷各劑量組分別按上述說(shuō)明每天灌胃給予相應(yīng)劑量的藥液，1次/d。給藥的同時(shí)，除了空白對(duì)照組外，其余各組小鼠每天頸背部皮下注射D-半乳糖1.25 g/kg，連續(xù)6周，建立D-半乳糖致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠模型[10，11]。

1.3 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的檢測(cè) 采用跳臺(tái)試驗(yàn)。末次給藥2 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)訓(xùn)練。首先將各組動(dòng)物放入跳臺(tái)箱適應(yīng)3 min，隨后將小鼠放于安全平臺(tái)上，同時(shí)通以24 V交流電，記錄各組小鼠5 min內(nèi)跳下平臺(tái)受電擊的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))和第1次跳下平臺(tái)的潛伏期。24 h后重復(fù)測(cè)試，直接將小鼠放于安全臺(tái)上并通電，記錄小鼠5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)和首次跳下平臺(tái)的潛伏期。

1.4 海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量的測(cè)定 跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束后，立即對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，斷頭處死小鼠，置于冰上迅速分離海馬與皮層，于冰冷生理鹽水中進(jìn)行勻漿，制成10%腦組織勻漿液，并用冷凍離心機(jī)在-4 ℃條件下3 000 r/min低溫離心15 min，吸取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用化學(xué)比色法分別檢測(cè)各組小鼠海馬組織中AChE活性、SOD活性和MDA含量。

1.5 海馬組織中Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫印跡試驗(yàn)。跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死小鼠，置于冰上迅速分離海馬，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞后以1 000 r/min離心10 min，以PBS洗2次，用PIPA細(xì)胞裂解液置冰浴裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后，取等量樣品以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，Bcl-2和Caspase-3抗體(濃度1∶100)孵育過(guò)夜，再以過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL顯影,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)的積分吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠跳臺(tái)潛伏期及跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)比較 見(jiàn)表1。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組跳臺(tái)潛伏期和跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)比較，P均<0.01，提示模型制作成功。

表1 各組小鼠跳臺(tái)潛伏期及跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)比較

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組海馬組織AChE、SOD活性和MDA含量比較 見(jiàn)表2。模型對(duì)照組與空白對(duì)照組各指標(biāo)比較，P均<0.01。

表2 各組AChE、SOD活性和MDA含量比較

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組海馬組織Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、越橘花色苷低劑量組、越橘花色苷中劑量組、越橘花色苷高劑量海馬組織Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.42±0.08、0.76±0.08、1.24±0.05、1.08±0.10、1.29±0.03，cleaved Caspase-3分別為0.51±0.03、0.97±0.05、0.65±0.07、0.86±0.08，0.62±0.01。與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.01)；與模型對(duì)照組比較，越橘花色苷中劑量組和高劑量組海馬組織cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.01)。越橘花色苷高劑量和中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，P均﹥0.05。

3 討論

衰老是生命發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)必經(jīng)階段，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力逐漸減弱甚至喪失，出現(xiàn)多器官、組織功能的衰退[12]。阿爾茨海默病(AD)，常被稱(chēng)為老年性癡呆，是嚴(yán)重影響老年人身心健康的主要疾病，近年發(fā)病率逐年增高。AD為一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為主要臨床癥狀，以大腦組織神經(jīng)元纖維纏結(jié)、中老年斑沉積為主要病理改變，發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前臨床仍無(wú)良好的防治藥物[13，14]。研究衰老和癡呆的動(dòng)物模型很多，給小鼠注射D-半乳糖致衰老模型是根據(jù)衰老的代謝學(xué)說(shuō)建立的一種常見(jiàn)的亞急性衰老模型，具備造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性良好等優(yōu)勢(shì)，已成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的模擬衰老動(dòng)物模型的方法[15]。

跳臺(tái)試驗(yàn)是一種常見(jiàn)的測(cè)試小型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)檢測(cè)方法[16]，本研究結(jié)果表明，D-半乳糖能夠明顯抑制小鼠在新環(huán)境下的自發(fā)活動(dòng)和探究能力，使小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能明顯減退，而越橘花色苷能夠顯著改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙情況，表現(xiàn)為小鼠的跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，潛伏期明顯延長(zhǎng)。提示越橘花色苷能夠改善D-半乳糖致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，“膽堿能學(xué)說(shuō)”和“Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)”是目前國(guó)內(nèi)外普遍公認(rèn)的發(fā)病學(xué)說(shuō)?！澳憠A能學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，AD患者體內(nèi)的AChE活性較正常人顯著升高，可以大量水解ACh，導(dǎo)致中樞ACh含量明顯下降，從而影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠海馬組織AChE活性明顯升高，給予越橘花色苷后，能夠顯著降低D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織AChE活性。提示越橘花色苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)AchE活性發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶的作用。

“Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，AD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，AD患者腦組織中異常沉積的Aβ蛋白會(huì)引起一系列的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中包括氧化應(yīng)激損傷，這將直接或間接損傷膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞，造成學(xué)習(xí)記憶能力受損。而SOD和MDA是反映機(jī)體氧化還原狀態(tài)的主要標(biāo)志物。SOD是機(jī)體的一種內(nèi)源性抗氧化酶，其活性降低能夠?qū)е履X部氧化應(yīng)激損傷；MDA作為一種重要的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其異常增加能夠間接反映體內(nèi)自由基的受損情況。本研究結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠海馬組織SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，給予越橘花色苷后，能夠明顯升高D-半乳糖致衰老小鼠海馬組織SOD活性、降低MDA含量。提示越橘花色苷可以通過(guò)抗氧化功能改善學(xué)習(xí)記憶功能，延緩機(jī)體衰老。

Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白是最早發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的基因，也是當(dāng)前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可以有效抑制細(xì)胞凋亡。 Caspases家族則是近年發(fā)現(xiàn)的在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的執(zhí)行蛋白酶，它通常以無(wú)活性前體的形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡時(shí)才被激活，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，它的激活標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段。因此，檢測(cè)cleaved Caspase-3的變化能夠準(zhǔn)確地反映腦內(nèi)神經(jīng)元的凋亡情況。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低。給予越橘花色苷后，各組cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均較模型對(duì)照組降低，Bcl-2蛋白表達(dá)隨著越橘花色苷濃度的升高呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。提示越橘花色苷改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用機(jī)制可能與增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，越橘花色苷具有改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的能力，其作用機(jī)制可能與改善小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)及抑制cleaved Casepase-3的表達(dá)相關(guān)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21102055)；吉林市科技局杰出青年人才培養(yǎng)計(jì)劃(20156429)。

昌盛(E-mail：lyw135@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.010

R338

A

1002-266X(2017)13-0036-04

2017-01-12)