胡 曄 邊愛淑 楊麗娜 樊 怡 馬健飛

法舒地爾對(duì)高糖培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞RhoA/Rock1、ROS、GSH-Px及TGF-β1表達(dá)的影響

胡 曄 邊愛淑 楊麗娜 樊 怡 馬健飛

目的：探討法舒地爾(FAS)對(duì)高糖培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV)RhoA/Rock1、活性氧(ROS)、GSH-Px及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響。 方法：將人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV分為對(duì)照組(葡萄糖濃度為0)、高糖組(葡萄糖濃度分別為1.5%、2.5%和4.25%)和FSA干預(yù)組(2.5%葡萄糖+FAS 12.5、25和50 μmol/L)。檢測(cè)方法：Q-PCR法和Western印跡法檢測(cè)RhoA和Rock1的表達(dá)；化學(xué)熒光法檢測(cè)ROS的含量；ELISA法檢測(cè)GSH-Px和TGF-β1的含量。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，高糖組可呈濃度依賴方式上調(diào)RhoA、Rock1、ROS及TGF-β1的表達(dá)，下調(diào)GSH-Px的表達(dá)；與2.5%高塘組相比，F(xiàn)AS干預(yù)可明顯下調(diào)RhoA、Rock1、ROS及TGF-β1的表達(dá)，上調(diào)GSH-Px的表達(dá)。 結(jié)論：FAS可能通過(guò)抑制Rho激酶活性抑制高糖培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Rho/Rho激酶 氧化應(yīng)激 腹膜透析 腹膜纖維化 法舒地爾

腹膜透析(PD)是終末期腎病患者腎臟替代治療的方法之一。氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)過(guò)度產(chǎn)生和(或)抗氧化防御功能減弱，造成組織、細(xì)胞損傷的一種狀態(tài)。研究表明，PD患者普遍存在氧化應(yīng)激狀態(tài)[1-2]。Rho被稱為小G蛋白超家族并具有GTP酶活性，Rock屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可與GTP-Rho相結(jié)合，是目前功能研究最為清楚的Rho下游靶效應(yīng)分子[3]。Rho/Rock信號(hào)通路參與眾多細(xì)胞功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、遷移、聚集和增殖等；同時(shí)還參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多個(gè)生物環(huán)節(jié)，其中包括炎癥，氧化應(yīng)激及纖維化等[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)被公認(rèn)為是最主要的促纖維化因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察高濃度葡萄糖對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞(HMrSV)RhoA/Rock1、ROS、GSH-Px及TGF-β1表達(dá)的影響及法舒地爾(FAS)能否抑制高糖對(duì)HMrSV所產(chǎn)生的作用，為PD相關(guān)性腹膜纖維化的預(yù)防和治療提供新的思路。

材料與方法

材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HMrSV細(xì)胞株由法國(guó)巴黎TENON醫(yī)院 Pierre RONCO教授建立；由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院徐惠綿教授及那迪醫(yī)師饋贈(zèng)。

主要試劑 改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；無(wú)支原體胎牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；PCR引物(大連寶生物合成)；兔抗人RhoA多克隆抗體(英國(guó)abcam公司)；兔抗人Rock1單克隆抗體(英國(guó)abcam公司)；活性氧測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1 ELISA試劑盒(R&D)。

方法

HMrSV復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 將凍存細(xì)胞的凍存管直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)的搖動(dòng)令其盡快融化，取出凍存管并吸出細(xì)胞懸液，加入已準(zhǔn)備好的10 ml 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，4℃離心(800 r/min，5 min)，得到細(xì)胞團(tuán)，棄上清，繼續(xù)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24h后達(dá)到80%以上可傳代，24h后再換液、傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞分組 腹膜間皮細(xì)胞融合到80%以上進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h同步化，隨機(jī)分以下各組：(1)對(duì)照組：只加入含10%胎牛血清(FBS1640)培養(yǎng)基作用24h；(2)不同葡萄糖濃度組：含10%FBS1640培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄糖(1.5%，2.5%，4.25%)分別作用24h；(3)葡萄糖加FAS干預(yù)組：含10%FBS1640培養(yǎng)基中加入不同濃度FAS(12.5 μmol/L,25 μmol/L,50 μmol/L)分別預(yù)孵育2h，各加入2.5%葡萄糖再孵育24h。

Q-PCR 法檢測(cè)RhoA，Rock1 的mRNA 表達(dá) Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí) 定量PCR 引物序列: RhoA 上游5’-GACTCGGATTCGTTGCCTGA- 3’，下游3’-ATCCACCTCGATATCTGCCACA- 5’; Rock1 上游5’-GGACAGATGCGGGAGCTACA- 3’，下游3’-TGCTAGATCCAACTGAGTAGCAAGA- 5’;反應(yīng)體系RhoA、Rock1及GADPH上下游引物各0.5 μl；SYBR Premix Ex TapII 6.25 μl；cDNA模板1.0 μl；去離子水4.25 μl；共12.5 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 30s預(yù)變性，95℃ 5s變性，60℃ 30s退火，共45個(gè)循環(huán)。ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參)CT值-(對(duì)照組目標(biāo)基因-對(duì)照組內(nèi)參)CT值，mRNA的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt×100%。

Western印跡法法檢測(cè)RhoA，Rock1的蛋白表達(dá) 冰上裂解細(xì)胞，4℃，12 000 r/min離心10 min，留取上清用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。總蛋白上樣量于10% SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉2h后，分別加入兔抗人RhoA抗體(1∶ 500)，兔抗人Rock1抗體(1∶ 500)，4℃過(guò)夜，洗膜，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶ 2 000)，山羊抗鼠IgG(1∶ 10 000)，室溫孵育2h，洗膜，ECL發(fā)光法顯影，掃描儀成像，自動(dòng)成像系統(tǒng)分析。

化學(xué)熒光法檢測(cè)ROS 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，加入DCFH-DA于培養(yǎng)基，37℃孵育細(xì)胞30 min后收集細(xì)胞，將收集好的細(xì)胞用PBS重懸，在熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)，讀出光密度OD值，設(shè)定最佳激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，最佳發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出檢測(cè)指標(biāo)的真實(shí)含量。

ELISA法檢測(cè)上清液GSH-Px及TGF-β1含量 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，顯色后用酶標(biāo)儀讀光密度OD值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出檢測(cè)指標(biāo)的真實(shí)含量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

高糖對(duì)HMrSV RhoA及Rock1蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高糖組HMrSV RhoA及Rock1的蛋白及mRNA表達(dá)量顯著增加，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 不同濃度葡萄糖作用下HMrSV RhoA及Rock1的蛋白及mRNA表達(dá)情況HMrSV:人腹膜間皮細(xì)胞;RhoA:Rho蛋白A;Rock1:RhoA激酶1;mRNA:信使RNA;β-actin為內(nèi)參；與0%組比較，*P<0.05；**P<0.01;A：Western印跡法；B：灰度定量分析法(對(duì)A圖的半定量分析)；C：Q-PCR法

FAS對(duì)高糖作用下HMrSV RhoA及Rock1蛋白及mRNA表達(dá)的影響 與2.5%高糖相比，F(xiàn)AS組HMrSV RhoA及Rock1的蛋白及mRNA表達(dá)量顯著下降，且隨著FAS濃度的增加，RhoA及Rock1的及mRNA表達(dá)量逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 FAS對(duì)高糖作用下HMrSV RhoA及Rock1的蛋白及mRNA表達(dá)情況FAS：法舒地爾；HMrSV:人腹膜間皮細(xì)胞;RhoA:Rho蛋白A;Rock1:RhoA激酶1;mRNA:信使RNA;β-actin為內(nèi)參；與0 μnol/L組比較，*P<0.05；**P<0.01;A：Western印跡法；B：灰度定量分析法(對(duì)A圖的半定量分析)；C：Q-PCR法

高糖對(duì)HMrSV ROS、GSH-Px和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高糖組HMrSV ROS和TGF-β1的蛋白表達(dá)量顯著增加，而GSH-Px的蛋白表達(dá)量顯著減少，均呈濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 葡萄糖作用下HMrSV ROS、GSH-Px和TGF-β1蛋白情況

HMrSV:人腹膜間皮細(xì)胞;ROS:活性氧;GSH-Px:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

FAS對(duì)高糖作用下HMrSV ROS、GSH-Px和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 與2.5%高糖相比，F(xiàn)AS組HMrSV ROS和TGF-β1的蛋白表達(dá)量顯著下降，GSH-Px的蛋白表達(dá)量顯著增加，呈FAS濃度依賴性(P<0.05)，但在FAS的濃度為50 μmol/L時(shí)，GSH-Px的蛋白表達(dá)量未見增加(表2)。

表2 FAS對(duì)高糖作用下HMrSV ROS、GSH-Px和TGF-β1蛋白情況

HMrSV:人腹膜間皮細(xì)胞;ROS:活性氧;GSH-Px:谷胱甘肽過(guò)氧化物酶;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；FAS法舒地爾;HG:高糖

討 論

PD是終末期腎病患者常用的替代療法之一，非生理性腹膜透析液的慢性刺激和反復(fù)腹膜透析相關(guān)感染共同引起腹膜間皮細(xì)胞損傷是腹膜纖維化發(fā)生的始動(dòng)因素[5]。研究表明，PD患者存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，通過(guò)多種途徑產(chǎn)生ROS，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)腹膜間皮細(xì)胞造成損傷[1-2]，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生。因此，深入探討腹膜氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和延緩腹膜纖維化具有重大意義。

Rho/Rock信號(hào)通路廣泛參與生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、基因表達(dá)等行為。RhoA主要通過(guò)Rho/Rock信號(hào)通路調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白微絲骨架的聚合，進(jìn)而影響細(xì)胞的極性和形態(tài)。FAS是目前在臨床及實(shí)驗(yàn)中常用的一種Rock抑制劑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移黏附、骨架重排、胞質(zhì)移動(dòng)及炎癥細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等，在分子基因水平調(diào)節(jié)炎癥、血栓形成、氧化及纖維化等相關(guān)的多種因子[6]。目前臨床常用于改善缺血性腦血管疾病。但其作用遠(yuǎn)不僅限于此。有研究證實(shí)，高糖環(huán)境下腹膜間皮細(xì)胞的線粒體可產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致氧化還原失衡，甚至出現(xiàn)細(xì)胞死亡[7-8]。Soliman等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠心肌細(xì)胞中，RhoA/Rock通路活化可激活PKCβ-2及ROS，從而破壞細(xì)胞骨架，損傷心肌細(xì)胞。還有實(shí)驗(yàn)表明Rho/Rock信號(hào)通路能激活Nox4(NADPH氧化酶-4)[10]，通過(guò)產(chǎn)生O2-、H2O2等ROS產(chǎn)物，引起氧化應(yīng)激。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶，可阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免收氧化應(yīng)激損傷。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可激活腹膜間皮細(xì)胞Rho/Rock信號(hào)通路，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起ROS蛋白表達(dá)上調(diào)，GSH-Px蛋白表達(dá)下調(diào)，同時(shí)FAS能顯著下調(diào)ROS蛋白的表達(dá)，上調(diào)GSH-Px蛋白的表達(dá)，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

TGF-β1被公認(rèn)為是最主要的促上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)因子[11]。Washida等[12]的研究表明，Rho激酶參與激活多個(gè)階段包括組織纖維化和血管生成的腹膜損傷，ROCK抑制劑可使組織纖維化區(qū)域及新生血管明顯減少，使TGF-β、纖維連接蛋白及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)顯著降低[12-13]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的過(guò)度表達(dá)和成肌纖維細(xì)胞的形成都依賴于RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。國(guó)內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)，Rho/Rho激酶信號(hào)通路的激活在大鼠腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮重要作用。證實(shí)了分別用4.25%透析液建立PD大鼠模型以及用一定濃度的TGF-β 刺激腹膜間皮細(xì)胞，都會(huì)激活Rho/Rho激酶信號(hào)通路，隨之使E-cadherin表達(dá)下降，α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)增加[15-16]。而本研究也發(fā)現(xiàn)，葡萄糖可呈濃度依賴方式刺激腹膜間皮細(xì)胞上調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)，F(xiàn)AS可顯著下調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖可激活人腹膜間皮細(xì)胞Rho/Rho激酶信號(hào)通路，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，上調(diào)促氧化因子ROS、下調(diào)抗氧化因子GSH-Px蛋白的表達(dá)，并上調(diào)纖維化標(biāo)志性因子TGF-β1蛋白的表達(dá)，而FAS可抑制Rho/Rho激酶信號(hào)通路的激活，顯著改善腹膜間皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，防止高糖對(duì)腹膜間皮細(xì)胞造成的損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)表明，RhoA/Rock信號(hào)通路參與了人腹膜間皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制RhoA/Rock信號(hào)通路的激活可有效阻止腹膜間皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，從而防止腹膜間皮細(xì)胞受到損傷，最終可防止及延緩腹膜纖維化的發(fā)生。但由于本實(shí)驗(yàn)只觀察到Rock抑制劑可降低ROS的過(guò)表達(dá)，而ROS是否就是RhoA/Rock的下游效應(yīng)分子尚無(wú)法證明，本實(shí)驗(yàn)也尚未證明氧化應(yīng)激指標(biāo)及纖維化指標(biāo)的變化有無(wú)時(shí)間先后，因此，更有待于進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯 加 則)

Effect of fasudil on RhoA/Rock1, ROS, GSH-Px and TGF-β1 expression of mesothelial cells with high glucose condition

HUYe,BIANAishu,YANGLina,FANYi,MAJianfei

DepartmentofNephrology,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

MAJianfei(E-mail:majiangfei@medmail.com)

Objective：To investigate the influence of fasudil on the expression of RhoA/Rock1, ROS, GSH-Px and TGF-β1 of human peritoneal mesothelioma cell line (HMrSV) cells incubated with high glucose. Methodology：HMrSV were divided into control group, high glucose group (the concentrations of glucose were 1.5%, 2.5% and 4.25%) and fasudil treatment group (glucose 2.5% + the concentrations of fasudil were 12.5, 25 and 50 μmol/L).The mRNA and protein expression levels of RhoA and Rock1 were detected with Q-PCR and Western blot, the expression of ROS was detected with chemical fluorescence, the protein content of GSH-Px and TGF-β1 in the supernatant were detected with ELISA. Results：Compared with the control group, glucose could increase the expression of RhoA, Rock1, ROS and TGF-β, and down-regulate the expression of GSH-Px in a concentration dependent manner (P<0.05). Fasudil could down-regulate the expression of RhoA, Rock1, ROS and TGF-β1, and increase the expression of GSH-Px (P<0.05). Conclusion：Fasudil can inhibit high glucose-induced oxidative stress response of HMrSV cells and it may produce effect through the inhibition of Rho kinase activity.

Rho/Rho kinase oxidative stress peritoneal dialysis peritoneal fibrosis fasudil

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.02.009

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370865)

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科(沈陽(yáng)，110001)

馬健飛(E-mail:majiangfei@medmail.com)

2016-09-09

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有