趙本書　牟玲

[摘要]目的：探討解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌感染與不孕不育的相關(guān)性。方法：選取2012年8月至2015年8月于我院診治的不孕不育癥患者800例納入不孕不育組，另選取同期于我院健康體檢或產(chǎn)檢者800例納入健康對照組。采用熒光定量PCR儀測定兩組患者解脲支原體、沙眼衣原體及淋病奈瑟氏菌DNA。結(jié)果：與健康對照組相比，不孕不育組患者解脲支原體感染、沙眼衣原體感染、解脲、沙眼衣原體同時感染、淋病奈瑟氏菌感染率明顯較高（P<0.05）。不孕不育組130對夫妻中丈夫和妻子的解脲支原體、沙眼支原體感染率分別為62.3%、59.2%、44.6%、39.2%，其夫妻間感染解脲支原體、沙眼支原體具有相關(guān)性（r=0.864，P<0.05；r=0.773，P<0.05）。結(jié)論：生殖道解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌感染與不孕不育相關(guān)，有必要對不孕不育夫妻同時檢測解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌DNA。

[關(guān)鍵詞]解脲支原體；沙眼衣原體；淋病奈瑟氏菌；不孕不育；相關(guān)性

解脲支原體、沙眼衣原體及淋病奈瑟氏菌通過性接觸傳播引起的泌尿生殖系統(tǒng)感染在臨床上越來越常見。由于這些病原體對人類生殖健康有著重要的不良影響，因此感染者往往容易出現(xiàn)不孕不育癥。隨著分子生物學(xué)及分子診斷學(xué)的快速發(fā)展，泌尿生殖系統(tǒng)感染病原體的檢測方法由傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、普通免疫法、PCR逐漸發(fā)展為實時熒光定量PCR法。實時熒光定量PCR法除了有高效、靈敏度高、特異性高等PCR特點及精確定量的光譜技術(shù)特點外，由于該技術(shù)全程檢測反應(yīng)均為全封閉，使PCR擴增產(chǎn)物污染的問題得到了根本的解決，因此還有污染小的特點，該技術(shù)的應(yīng)用使泌尿生殖系統(tǒng)感染病原體DNA檢測具有劃時代的意義，使臨床檢測及基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)來源更加及時、可靠。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定不育不孕癥患者解脲支原體、沙眼衣原體及淋病奈瑟氏菌DNA，探討這些病原體感染予不孕不育的相關(guān)性。

1.資料及方法

1.1一般資料

選取2012年8月至2015年8月于我院診治的不孕不育癥患者，階段整群抽樣選取800例，納入不孕不育組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）1年未采取任何避孕措施，性生活正常而沒有成功妊娠；（2）所有患者自愿參加本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重器官功能障礙；（2）有精神障礙或不配合檢查者。年齡20-45歲，平均（28.9±3.5）歲，男425例，女375例；其中有130對為不孕不育夫妻。另選取同期于我院健康體檢或產(chǎn)檢者800例納入健康對照組，年齡18～47歲，平均（29.3±3.8）歲，男452例，女348例。性別、年齡在不孕不育組與健康對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有良好的可比性。

1.2檢測儀器與試劑盒

采用ABI-7500全自動熒光定量PCR儀及中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定解脲支原體、沙眼衣原體及淋病奈瑟氏菌DNA（生產(chǎn)批號：S20150093）。

1.3取標(biāo)本及處理

所有取標(biāo)本操作均由婦產(chǎn)科及泌尿外科醫(yī)生完成。（1）女性標(biāo)本：先用干凈棉簽?zāi)ǖ糇訉m頸外口分泌物，在用一次性女性專用無菌棉簽在宮頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)3圈，取宮頸管內(nèi)分泌物于配套管內(nèi)。（2）男性標(biāo)本：將一次性男性專用拭子伸入尿道內(nèi)3cm后旋轉(zhuǎn)幾圈，停留半分鐘后取出置于配套管內(nèi)。標(biāo)本取好后立即封閉并送檢。標(biāo)本處理及提取DNA過程由檢測專業(yè)人員嚴(yán)格按照說明書進行：將棉拭子從生物安全柜中取出后置于EP管內(nèi)，加入1.5mL無菌生理鹽水充分混勻懸浮后去掉棉拭子，將EP管放入離心機內(nèi)以12000r/min離心3min，去掉上清留取沉淀備用。

1.4擴增DNA及判定結(jié)果

將2uL標(biāo)本DNA、陽性定量參考物及質(zhì)控品DNA先后加入擴增管內(nèi)，置于離心機以8000r/min離心5s后放進全自動熒光定量PCR儀進行擴增，每次檢測均分為空白對照、陰性及陽性。PCR儀參數(shù)設(shè)定：93℃3min預(yù)變；93℃45s后進入55℃lmin持續(xù)10個循環(huán)當(dāng)作熒光本底信號；93℃ 30s后進入55℃45s持續(xù)30個循環(huán)，在55℃時可收集熒光。用ct值代表擴增結(jié)果，為使標(biāo)準(zhǔn)曲線效果最佳，需根據(jù)陽性定量參考品結(jié)果進行分析并對基線及閾值進行調(diào)整，使線性相關(guān)系數(shù)r在0.97以上。結(jié)果判定：ct值在30及以上或增長曲線未表現(xiàn)為s型則代表標(biāo)本DNA量比檢測極限少，記錄為陰性；反之則為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

將本組數(shù)據(jù)錄入SPSS19.0進行分析，計數(shù)資料行x2檢驗，不孕不育組夫妻間感染解脲支原體、沙眼支原體則采用相關(guān)性分析，如P<0.05，則差異存統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1兩組患者病原體感染率比較

與健康對照組相比，不孕不育組患者解脲支原體感染、沙眼衣原體感染、解脲、沙眼衣原體同時感染、淋病奈瑟氏菌感染率明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2不孕不育組夫妻間感染解脲支原體的相關(guān)性分析

不孕不育組130對夫妻中丈夫和妻子的解脲支原體感染率分別為62.3%、59.2%，其夫妻間感染解脲支原體具有相關(guān)性（r=0.864，P<0.05）。見表2。

2.3不孕不育組夫妻間感染沙眼支原體的相關(guān)性分析

不孕不育組130對夫妻中丈夫和妻子的沙眼支原體感染率分別為44.6%、39.2%，其夫妻間感染沙眼支原體具有相關(guān)性（r=0.773，P<0.05）。見表3。

3.討論

隨著人們社交頻繁及性意識的改變，由于不潔性行為引起的泌尿生殖系統(tǒng)感染發(fā)生率也隨著上升。且人們普遍缺乏性衛(wèi)生知識，自我保護意思不強，使泌尿生殖系統(tǒng)感染進一步增加，因此對人類生殖健康帶來嚴(yán)重的威脅。Ruiying等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界約有8%-10%的育齡夫妻患不孕不育癥，其中20%～60%的不孕不育病因為泌尿生殖系統(tǒng)感染，而導(dǎo)致生殖系統(tǒng)炎癥的重要病原體為解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌。

解脲支原體主要的傳播方式是性傳播，其主要是通過粘附在泌尿生殖道表皮細(xì)胞表層來對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，從而導(dǎo)致輸卵管炎、子宮內(nèi)膜炎、宮頸炎等，因此患者常常有外陰瘙癢等癥狀。近年來解脲支原體感染與不孕不育癥的相關(guān)性逐漸成為研究熱點。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，不孕不育組患者解脲支原體感染率明顯較高（P<0.05）。解脲支原體感染引起不孕的機制主要為引起子宮內(nèi)膜及輸卵管的慢性炎癥。除此之外，感染誘發(fā)的自身免疫反應(yīng)可能與不孕有關(guān)。解脲支原體可以同時粘附在巨噬細(xì)胞和精子表面，對精子運動產(chǎn)生阻擋，且其還能分泌神經(jīng)氨酸酶樣物質(zhì)對精子和卵細(xì)胞的結(jié)合產(chǎn)生干擾，使不孕的可能性增大。

作為革蘭陰性病原體，沙眼衣原體有兩種發(fā)育形式，即始體和原體，其中感染力較強的原體，其侵入的靶細(xì)胞主要是柱狀上皮細(xì)胞，因此常常累及宮頸。沙眼衣原體感染機體后主要在宮頸、尿道及精液中存活，通過性接觸、直接體液接觸等方式來傳播。沙眼衣原體引起的泌尿生殖系統(tǒng)感染在歐美國家已超過了淋病奈瑟氏菌，在性傳播疾病病原體中排第一位，我國雖然還是淋病奈瑟氏菌作為性傳播疾病首位致病菌，但沙眼衣原體感染率也逐年上升。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，不孕不育組患者沙眼衣原體感染率明顯較高（P<0.05），與鎖丙榮等研究結(jié)果相符。其機制可能為沙眼衣原體感染可引起生殖道炎癥及粘連，嚴(yán)重時閉塞，同時可引起生殖道黏膜細(xì)胞壞死，從而使機體免疫系統(tǒng)與精子直接相接觸，通過分泌精子抗體來殺死精子而導(dǎo)致不孕。同時，沙眼衣原體感染可降低宮頸黏液的葡萄糖含量，使進入宮頸的精子活力下降而影響受精過程。沙眼衣原體侵占男性附睪及前列腺可改變精液的生理功能而導(dǎo)致不育。本研究結(jié)果顯示，不孕不育夫妻間感染解脲支原體、沙眼支原體具有相關(guān)性（r=0.864，P<0.05；r=0.773，P<0.05）。因此，不孕不育癥夫妻雙方有一方感染解脲支原體或沙眼支原體都應(yīng)常規(guī)讓配偶同時檢測。

作為革蘭染色陰性雙球菌，淋病奈瑟氏菌是引起不育的重要病原體。其主要是通過單個植入的方式粘附在精子細(xì)胞膜表面，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，進而入侵到精子細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，使精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞，對精子密度、活力產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響，甚至導(dǎo)致精子死亡而出現(xiàn)少精癥、無精癥。朱海燕等研究發(fā)現(xiàn)，其也可通過侵犯輸卵管引起炎癥、粘連和阻塞，使輸卵管上皮細(xì)胞分泌功能和纖毛擺動功能受損，而影響受精過程。

綜上所述，生殖道解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌感染與不孕不育相關(guān)，有必要對不孕不育夫妻，特別是原因不明的不孕不育，同時檢測解脲支原體、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌DNA。