張傳領(lǐng)， 邸 桐，王文婧，牛麗麗，肖 瑞

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010110；3. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

研究報(bào)告

母嬰分離應(yīng)激對(duì)rd新生小鼠行為的影響

張傳領(lǐng)1， 邸 桐2，王文婧3，牛麗麗2，肖 瑞2

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010110；3. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016)

目的 rd小鼠是一種出生1周左右自發(fā)致盲的遺傳性視網(wǎng)膜變性小鼠。通過母嬰分離應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)rd新生小鼠的焦慮樣和抑郁樣行為的影響，初步評(píng)價(jià)rd小鼠能否成為眼部疾病與焦慮抑郁研究新的模型。方法 將出生第1天的rd小鼠分為母嬰分離組(n=9)和對(duì)照組(n=9)。母嬰分離組每天與母鼠分離4 h，共分離28 d。從第29天開始行為測(cè)試實(shí)驗(yàn)，通過Smart3動(dòng)物行為跟蹤軟件檢測(cè)母嬰分離組和對(duì)照組在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和十字高架實(shí)驗(yàn)中的焦慮樣行為，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的抑郁樣行為。結(jié)果 在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，母嬰分離組在曠場(chǎng)中心的時(shí)間比例(0.88%)和運(yùn)動(dòng)距離(28.17±5.65)cm均明顯少于對(duì)照組(2.61%，109.9±9.79 cm；P=0.04,P=0.001);在十字高架實(shí)驗(yàn)中，母嬰分離組在開放臂的時(shí)間(40.64±4.13)s明顯少于對(duì)照組(91.73±11.26 s，P<0.01); 在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，母嬰分離組的不動(dòng)時(shí)間(126.5±10.22)s明顯多于對(duì)照組(77.75±16.83 s，P=0.02)；在懸尾實(shí)驗(yàn)中，母嬰分離組的不動(dòng)時(shí)間(21.56±6.83)s多于對(duì)照組(7.37±3.22 s，P=0.03)。 結(jié)論 rd小鼠母嬰分離28 d應(yīng)激，能夠明顯增加rd小鼠的焦慮樣行為和抑郁樣行為。

rd小鼠；母嬰分離；開放場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；十字高架實(shí)驗(yàn)；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)；懸尾實(shí)驗(yàn)

人類生活早期應(yīng)激(early life stress, ELS)，是誘發(fā)焦慮、抑郁等多種精神疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。流行病學(xué)的研究結(jié)果表明那些在身體和情感上受到傷害兒童在發(fā)育過程中具有很高的焦慮障礙[1,2]和抑郁癥風(fēng)險(xiǎn)[3]。ELS動(dòng)物模型已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于研究精神類疾病機(jī)理中。動(dòng)物研究顯示，母嬰分離導(dǎo)致動(dòng)物行為異常而出現(xiàn)焦慮和抑郁樣反應(yīng)[4]。目前主要有兩種常用的產(chǎn)后處理方法來(lái)模擬早期生活應(yīng)激，早期剝奪(early deprivation (ED)和母子分離(maternal separation, MS)。母子分離方式包括每天將新生動(dòng)物和其母親短時(shí)間分離1 h[5, 6]和3～6 h的長(zhǎng)時(shí)間分離[7]持續(xù)1～3周。母子分離應(yīng)激在豬、豚鼠和鳥類中都有所使用，最廣泛的是應(yīng)用在大鼠和小鼠上。經(jīng)歷MS 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年后的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)以及精神行為具有廣泛的影響。生命早期不良應(yīng)激對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響逐步引起關(guān)注，母嬰分離逐漸成為了研究精神類疾病的有效工具，特別是研究生命早期不良應(yīng)激對(duì)抑郁癥的病理過程的影響正逐步成為研究熱點(diǎn)[8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于母子分離實(shí)驗(yàn)研究主要使用的正常大小鼠，極少用患有某種生理疾病的老鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Rd小鼠作為一種在哺乳期就因視網(wǎng)膜退化而失明的小鼠，在研究母嬰分離應(yīng)激中尚未有相關(guān)研究報(bào)道。中國(guó)是全世界盲人最多的國(guó)家，據(jù)世界衛(wèi)生組織2010統(tǒng)計(jì)，中國(guó)盲人(blind)824.8萬(wàn)，低視力(low vision)6727.4萬(wàn)，視力殘疾(visual impairment)是兩者的總和7551.2萬(wàn)[9]。本實(shí)驗(yàn)試圖為從小致盲人群在外界應(yīng)激作用下行為變化提供基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為盲人抑郁癥治療和護(hù)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

rd小鼠, rd1 (PDE6brd1; CBA/J) 小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式生物所(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2015-0001；于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配種飼養(yǎng),循環(huán)光照(光照12 h,黑暗12 h), 環(huán)境溫度約為25℃,無(wú)菌環(huán)境下飼養(yǎng)。Smart3動(dòng)物行為跟蹤系統(tǒng)(Pan lab,西班牙), 敞箱(自制，邊長(zhǎng)45 cm，高50 cm)，十字高架(自制，臂長(zhǎng)66 cm，高50 cm)，燒杯(1 000 mL)，懸尾裝置(自制)，攝像機(jī)(索尼，日本)。

1.2 方法

1.2.1 母子分離應(yīng)激設(shè)計(jì)：雌雄Rd成年鼠2∶1 合籠交配，待雌鼠懷孕后單籠飼養(yǎng)。生產(chǎn)后選9只新生rd鼠(5只雄性，4只雌性)實(shí)驗(yàn)組即母嬰分離組(ms)，從出生第1天起(P1)，每天上午(9:00～13:00)與母鼠分離4 h，之后放回母鼠身邊。共分離28 d。分離期間幼鼠禁食禁水。對(duì)照組新生小鼠9只不做任何處理。母嬰分離應(yīng)激結(jié)束后即第29天開始進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test, OFT):將待測(cè)rd小鼠放入測(cè)試房間適應(yīng)1 h，后將rd小鼠放入曠場(chǎng)反應(yīng)箱的中央部位。用攝像機(jī)記錄下rd小鼠5 min內(nèi)在曠場(chǎng)內(nèi)的活動(dòng)情況。后用Smart3小動(dòng)物識(shí)別跟蹤系統(tǒng)的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)K進(jìn)行跟蹤分析。計(jì)算rd小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)總路程(total distance traveled)，中央?yún)^(qū)域總路程，在中央?yún)^(qū)域(center zone)停留時(shí)間與總時(shí)間的百分比等參數(shù)。

1.2.3 十字高架迷宮測(cè)試(elevated plus-maze test，EPMT)：將待測(cè)rd小鼠放入測(cè)試房間適應(yīng)1 h。后將 rd小鼠放入十字高架中心區(qū)(central area),頭部面對(duì)開放臂。有攝像機(jī)記錄下rd小鼠5 min內(nèi)在十字高架內(nèi)的活動(dòng)情況，用Smart3小動(dòng)物識(shí)別跟蹤系統(tǒng)的十字高架模塊進(jìn)行跟蹤分析rd小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時(shí)間。

1.2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swim test, FST):將待測(cè)rd小鼠放入測(cè)試房間適應(yīng)1 h。后將 rd小鼠放入1000 mL大燒杯中，水溫為26℃，水深為12 cm。有攝像機(jī)記錄下6 min內(nèi)rd小鼠燒杯內(nèi)的活動(dòng)情況， 然后用Smart3小動(dòng)物識(shí)別跟蹤系統(tǒng)的強(qiáng)迫游泳模塊進(jìn)行跟蹤分析不動(dòng)時(shí)間。

1.2.5 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST):將待測(cè)rd小鼠放入測(cè)試房間適應(yīng)1 h。后將 rd小鼠尾部后2 cm處用膠帶固定，懸掛于支架上，計(jì)時(shí)6 min后停止。用Smart3小動(dòng)物識(shí)別跟蹤系統(tǒng)的懸尾實(shí)驗(yàn)?zāi)K進(jìn)行跟蹤分析rd小鼠在測(cè)試時(shí)間內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析:測(cè)定值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( Mean ±s) 表示。采用GraphPad Prism 6軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

母嬰分離組(MS)組平均總運(yùn)動(dòng)路程為2106±249.7 cm對(duì)照組(control)平均總運(yùn)動(dòng)路程為2797±211.9 cm。母子分離組走過的總路程比對(duì)照組短，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性(P=0.049)。MS組和對(duì)照組在周圍區(qū)域運(yùn)動(dòng)路程分別為(2077±247.4) cm和(2687±206.0) cm，兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異沒有顯著性(P=0.074)。而在中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)路程兩組差異有非常顯著性(P<0.0001)，MS組的平均運(yùn)動(dòng)距離為28.17±5.65 cm，而對(duì)照組在中間區(qū)域的平均運(yùn)動(dòng)距離為(109.9±9.79) cm(圖1)。從小鼠在中間區(qū)域停留時(shí)間占總時(shí)間的百分比看， MS組為0.88%，對(duì)照組為2.61%，兩組差別有顯著性(P=0.0015)(圖2)。

2.2 十字高架實(shí)驗(yàn)

在rd小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)方面， MS組(13.80±2.51)次與對(duì)照組(12.20±1.11)次差異沒有顯著性(P=0.78)(圖3)。而rd小鼠在開放臂的時(shí)間來(lái)看，ms組(40.64±4.13)s明顯少于對(duì)照組(91.73±11.26)s(圖4)。

2.3 強(qiáng)迫游泳

母嬰分離組在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的平均不動(dòng)時(shí)間為(126.5±10.22) s，對(duì)照組為(77.75±16.83) s，母嬰分離組明顯多于實(shí)驗(yàn)組(P=0.02)(圖5)。

2.4 懸尾實(shí)驗(yàn)

母嬰分離組在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的平均不動(dòng)時(shí)間為(21.56±6.83) s，對(duì)照組為(7.37±3.22) s，母嬰分離組明顯多于實(shí)驗(yàn)組(P=0.03)(圖6)。

圖1 rd小鼠在開放場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離比較Fig.1 Traveled distance of rd mice in open field test

圖2 母嬰分離組(MS)與對(duì)照組(control)在開放場(chǎng)中心區(qū)停留時(shí)間比例Fig.2 Time ratio of center zone vs total zone of the two groups mice in open field test

圖3 母嬰分離組(MS)與對(duì)照組(control)小鼠在十字高架中進(jìn)入開放臂次數(shù)Fig.3 Entries in the open arms between MS and control groups

圖4 母嬰分離組(MS)與對(duì)照組(control)小鼠在開放臂停留時(shí)間Fig.4 Time in open arms between the MS and control groups

圖5 母嬰分離組(MS)與對(duì)照組(control)強(qiáng)迫游泳中不動(dòng)時(shí)間Fig.5 Immobility time between the MS and control groups in force swim test

圖6 實(shí)驗(yàn)組(MS)與對(duì)照組(control)在懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間Fig.6 Immobility time between the MS and control groups in tail suspend test

3 討論

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)又稱敞箱實(shí)驗(yàn)，是測(cè)試嚙齒類動(dòng)物焦慮樣行為的常用的方法，曠場(chǎng)區(qū)域要比鼠籠大很多，嚙齒類動(dòng)物天生傾向于靠近有壁的地方活動(dòng)，而避免在中心不可預(yù)測(cè)的地方活動(dòng)。測(cè)量它們?cè)谥行膮^(qū)域的探究行為是和焦慮相關(guān)的的指標(biāo)[10,11]。本實(shí)驗(yàn)在rd小鼠在周邊路程在沒有顯著性差異情況下，停留在中心區(qū)域的的時(shí)間，中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)距離和總運(yùn)動(dòng)距離母嬰分離組明顯少于對(duì)照組，從開放場(chǎng)結(jié)果看，rd小鼠母嬰分離后焦慮樣行為更明顯。

十字高架實(shí)驗(yàn)是評(píng)估嚙齒類動(dòng)物焦慮樣反應(yīng)的很受歡迎的方法。十字高架有一對(duì)閉合臂和一對(duì)開放臂構(gòu)成，高架離地面50 cm，實(shí)驗(yàn)利用小鼠對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突來(lái)考察小鼠的焦慮狀態(tài)。用小鼠在開放臂的次數(shù)和時(shí)間來(lái)衡量其焦慮狀態(tài)[12,13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，母子分離組進(jìn)入開放臂的時(shí)間要比對(duì)照組要少，說明母子分離讓rd小鼠比正常組小鼠表現(xiàn)出更多的焦慮樣行為。

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行抗抑郁藥初步篩選和判斷嚙齒類動(dòng)物抑郁樣行為的有效的測(cè)試實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)對(duì)象放到灌水的圓柱體中，造成不可逃脫的環(huán)境，以測(cè)試時(shí)間內(nèi)嚙齒類動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間作為指標(biāo)[14]。本實(shí)驗(yàn)在強(qiáng)迫游泳的結(jié)果中顯示母子分離rd小鼠28 d，增加了rd小鼠的抑郁樣行為。

懸尾實(shí)驗(yàn)是基于小鼠被懸尾后，在一種短期的無(wú)法逃脫的有害環(huán)境中，產(chǎn)生絕望，表現(xiàn)出靜止不動(dòng)。該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估小鼠的抑郁樣行為[15,16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示母子分離組rd小鼠較對(duì)照組抑郁樣行為明顯增加。

臨床和流行病學(xué)調(diào)查顯示失明和眼部疾病與抑郁癥和焦慮有廣泛的聯(lián)系[17,18]。如何進(jìn)行動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的研究一直沒有合適的動(dòng)物品系。Rd小鼠具有視網(wǎng)膜變性基因病變，在出生后第7天左右視網(wǎng)膜退化導(dǎo)致小鼠失明。而國(guó)內(nèi)外關(guān)于母子分離實(shí)驗(yàn)選取生理正常的大小鼠進(jìn)行，其結(jié)果在不同品種大小鼠之間結(jié)果也缺乏穩(wěn)定的一致性[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示遺傳性致盲小鼠在母子分離應(yīng)激中也表現(xiàn)出更高的焦慮樣和抑郁樣行為。rd小鼠能否成為研究眼部疾病與焦慮和抑郁的新的動(dòng)物模型，需要在機(jī)制上進(jìn)一步在研究。

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Effect of maternal separation stress on behavior of neonatal rd mice

ZHANG Chuan-ling1, DI Tong2, WANG Wen-jing3, NIU Li-li2, XIAO Rui2

(1. School of Pharmacy, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010110，China;2. Key Laboratory of Molecular Pathology, Inner Mongolian Medical University, Huhhot 010059；3. School of Life Sciences and Biopharmaceutics; Shenyang Pharmaceutical University; Shenyang 110016)

Objective To evaluate the effect of maternal separation stress on the behavior of neonatal rd mice. Methods Neonatal rd mice were divided into maternal separation (MS) group (n=9) and control group (n=9). MS-stress was induced in the MS group by 4-hour-separation per day for 28 days. Open field test, elevated plus maze test, forced swim test and tail suspension test were used to evaluate the anxiety-like and depression-like behavior of the neonatal rd mice.Results The stay time and distance travelled of MS group in the central zone were 0.88% and 28.17±5.65 cm, respectively, significantly shorter than that of the control group (2.61%，109.9±9.79 cm.P=0.04,P=0.001). Compared with the control group, the stay time in open arms of the MS group was significantly decreased (P<0.01), while the immobility time in forced swim test and tail suspension test of the MS group were 126.5±10.22 s and 21.56±6.83 s, significantly longer than that of the control group (77.75±16.83 s,P=0.02, 7.37±3.22 s,P=0.03). Conclutions The 28-day maternal separation stress can significantly increase the anxiety-like and depression-like behavior in neonatal rd mice.

rd mice, neonatal; Maternal separation; Stress; Open field test; Elevated plus maze test; Force swim test; Tail suspension test; Anxiety-like behavior; Depression-like behavior

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)31260260),內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(編號(hào)：nybq2010zcl)。

張傳領(lǐng)(1978-),男，博士,講師,主要研究方向：民族藥學(xué),神經(jīng)藥理。

肖瑞(1979-),女，博士,教授,主要研究方向：分子病理,神經(jīng)退行性疾病，E-mail:xiaorui79@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.015

2016-11-28