陳爽 葉盛 凌華 喻臻 唐云

400042 重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測(cè)所

·論著·

重慶市2011—2016年甲型H1N1流感病毒分離株NA基因變異分析

陳爽 葉盛 凌華 喻臻 唐云

400042 重慶市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測(cè)所

目的 研究重慶市2011—2016年甲型H1N1流感病毒株神經(jīng)氨酸酶(NA)基因特征，為甲型H1N1流感病毒感染的監(jiān)測(cè)和預(yù)防提供試驗(yàn)依據(jù)。方法 按分離時(shí)間及地點(diǎn)的不同選取43株甲型H1N1流感病毒，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增病毒NA基因片段并進(jìn)行序列測(cè)定，進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列分析。結(jié)果 基于NA基因的進(jìn)化樹顯示，2011—2016年的甲型H1N1流感病毒與疫苗株關(guān)系均較近。43株病毒之間的NA基因同源性較高，與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的核苷酸同源性為97.9%～99.4%，氨基酸同源性為96.8%～98.9%。研究中大部分甲型H1N1病毒NA蛋白上都具有疫苗株NA蛋白具有的8個(gè)糖基化位點(diǎn)，但也有部分毒株增加42位(NQS)的糖基化位點(diǎn)，或者丟失386位的糖基化位點(diǎn)。結(jié)論 甲型H1N1病毒的NA序列變異情況逐年增加，但總體上來說，重慶地區(qū)大部分甲型H1N1病毒仍對(duì)達(dá)菲敏感；同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測(cè)，為制定應(yīng)對(duì)甲型H1N1流感流行措施提供參考。

流行性感冒病毒(Influenza virus，簡(jiǎn)稱流感病毒)，屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，按核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, NP)和基質(zhì)蛋白(Matrix protein, MP)不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3 型。其中，甲型流感病毒[Influenza A(H1N1) virus]因其表面的血凝素(Hemagglutin, HA)有16個(gè)亞型，神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)有9個(gè)亞型，變異、重組非常頻繁，在引起人類流感流行史上有十分重要的意義。HA基因是流感病毒主要抗原基因，其編碼的HA蛋白具有免疫原性，能使人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體；而NA 基因編碼的NA蛋白是其表面另一種重要的糖蛋白，是NA抑制劑的主要作用點(diǎn)，NA抑制劑也成為WHO推薦預(yù)防和治療甲型H1N1流感的首選藥物，NA催化活性位點(diǎn)、抗原決定簇及糖基化位點(diǎn)的變化均會(huì)導(dǎo)致NA抑制劑敏感性發(fā)生改變，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象[1]。

在對(duì)重慶地區(qū)的甲型H1N1流感病毒HA基因進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)該病毒的HA基因已經(jīng)累積了一定的變異[2]；而重慶地區(qū)的甲型H1N1流感病毒的NA基因相關(guān)研究暫未見報(bào)道。因此，依托重慶本地的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)本地區(qū)2011—2016年甲型H1N1流感病毒的NA基因特征進(jìn)行分析，以了解其遺傳進(jìn)化特征和變異情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)具有流行病學(xué)意義的耐藥株，為我市甲型H1N1流感病毒流行的防治和預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

圖1 重慶市2011年1月至2016年6月流感監(jiān)測(cè)情況Fig.1 Surveillance of influenza in Chongqing from Jan. 2011 to Jun. 2016

1.1 病毒分離 2011年1月至2016年6月，對(duì)重慶市疾控中心流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室各個(gè)哨點(diǎn)醫(yī)院的樣品，以及重慶市各區(qū)縣流感暴發(fā)樣本，根據(jù)流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，進(jìn)行核酸檢測(cè)和病毒分離。將分離到的流感病毒株中的甲型H1N1病毒株，按不同采樣地點(diǎn)和分離時(shí)間，選取代表毒株。

1.2 目的基因擴(kuò)增 將選取的病毒分離株，用德國(guó)QIAGEN公司全自動(dòng)核酸提取儀QIAxtractor及配套的RNA核酸提取試劑QIAxTractor Reagent Pack VX提取病毒核酸，用德國(guó)Qiagen公司一步法RT-PCR試劑盒OneStep RT-PCR Kit和上海英駿公司合成的WHO發(fā)布的甲型H1N1流感病毒全基因組測(cè)序引物[4]中NA片段引物，完成病毒NA基因核酸的PCR擴(kuò)增，經(jīng)美國(guó)Invitrogen公司E-Gel? 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)電泳后，觀察到目的條帶確認(rèn)目的片段擴(kuò)增成功。

1.3 基因測(cè)序與序列分析 含有目的片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物直接送大連寶生物和上海英駿公司進(jìn)行基因測(cè)序和拼接。測(cè)序所得序列采用BIOEDIT 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)和剪切；采用MEGA 6.0基于Neighbour-joining(NJ)法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行序列分析和氨基酸位點(diǎn)差異分析，以及進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列差異分析；使用NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 重慶市2011年1月至2016年6月流感監(jiān)測(cè)病原學(xué)分析 從2011年1月至2016年6月間，重慶5家國(guó)家級(jí)流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室共檢測(cè)疑似流感標(biāo)本26 218份，其中3 568份標(biāo)本核酸陽性，陽性率為13.61%。其中678份標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果為甲型H1N1，占標(biāo)本總數(shù)的2.59%。從時(shí)間分布上看，甲型H1N1在2011年1—3月，2013年1—6月、10—12月出現(xiàn)流行高峰，為當(dāng)季優(yōu)勢(shì)毒株。在2011年7—9月，2012年10—12月，2013年7—9月，2014年1—3月，2016年1—6月有散在毒株出現(xiàn)(圖1)。共分離得到甲型H1N1病毒289株。本研究按病毒對(duì)應(yīng)的原始標(biāo)本的采集時(shí)間和采集地點(diǎn)的不同，從中選取了43株甲型H1N1病毒，擴(kuò)增NA基因并測(cè)序，經(jīng)過拼接和整理后得到其NA基因組序列信息。

注：Bootstrap method，Bootstrap value:1000圖2 基于NA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Note: Bootstrap method，Bootstrap value:1000Fig.2 Phylogenetic analysis of NA gene sequences

2.2 基因進(jìn)化分析 經(jīng)與WHO推薦疫苗株A/California/07/2009(H1N1)(以下簡(jiǎn)稱疫苗株)NA基因序列(Genbank ID: KU933487.1)比對(duì)，43株2011年至2016年毒株均未出現(xiàn)核苷酸插入與缺失。將上述43株病毒的NA基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中不同年代、不同分離地點(diǎn)的甲型H1N1流感病毒的NA序列對(duì)齊剪切后生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果顯示， 2009年、2011年至2016年的甲型H1N1流感病毒與疫苗株關(guān)系均較近，相同年份的毒株聚集在一個(gè)小分枝下，不同年份的毒株按年聚集在一起，在大分枝交叉分布。從2009年開始，越早分離的病毒在進(jìn)化樹中的位置離疫苗株相對(duì)更近，后分離得到的病毒在進(jìn)化樹中的位置離疫苗株相對(duì)更遠(yuǎn)，如：2009年與2011年的病毒比2013年和2016年的病毒離疫苗株更近。

2.3 核苷酸及氨基酸差異情況 43株分離株的NA基因的核苷酸同源性為96.8%～100%，氨基酸同源性為95.8%～100.0%；與疫苗株的核苷酸同源性為97.9%～99.4%，氨基酸同源性為96.8%～98.9%(表1)。

表1 2011—2016年甲型H1N1流感病毒株NA基因核苷酸及氨基酸同源性

表2 2011—2016年甲型H1N1毒株相對(duì)疫苗株的NA氨基酸位點(diǎn)變化情況

續(xù)表2 2011—2016年甲型H1N1毒株相對(duì)疫苗株NA氨基酸位點(diǎn)變化情況

續(xù)表2 2011—2016年甲型H1N1毒株相對(duì)疫苗株NA氨基酸位點(diǎn)變化情況

2.4 氨基酸變異情況 2011—2016年間的43株甲型H1N1分離株與疫苗株的NA氨基酸序列僅存在一個(gè)共同的差異位點(diǎn)：N248D(按N1排序，以下出現(xiàn)的氨基酸序列均為N1排序)。2011年的19株序列與疫苗株相比，全部出現(xiàn)V106I變異的情況；2013年的16株序列與疫苗株相比，全部出現(xiàn)N44S、N200S、V241I、N248D、N369K變異；2016年的8株序列與疫苗株相比，全部出現(xiàn)N44S、N200S、V241I、N248D、V264I、N270K、I321V、N369K、N386K、K432E變異。除此之外，各年度還有部分毒株相對(duì)于疫苗株出現(xiàn)氨基酸變異的情況(表2)。

2.4.1 酶活性位點(diǎn)變異：NA 蛋白的酶催化活性位點(diǎn)位于4聚體每個(gè)亞單位球狀頭部的表面，其相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸組成高度保守。NA 蛋白的酶活性位點(diǎn)包括8 個(gè)催化位點(diǎn)，分別是R118、D151、R152、R225、E277、R293、R368、Y402和11個(gè)輔助位點(diǎn)E119、R156、W179、S180、D199、I223、E228、H275、E278、N295、E425[5,6]。本次研究的毒株中，A/重慶渝中/SWL11297/2013(H1)出現(xiàn)D151E變異，A/重慶巴南/SWL1677/2013(H1)出現(xiàn)H275Y變異，此兩株毒株出現(xiàn)了位于NA蛋白的催化位點(diǎn)或輔助位點(diǎn)的變異，且A/重慶巴南/SWL1677/2013(H1)出現(xiàn)H275Y的變異，提示此毒株是達(dá)菲耐藥株[7,8]。

2.4.2 抗原決定簇變異：通常認(rèn)為流感病毒NA蛋白的抗原決定簇有7個(gè)氨基酸區(qū)域，分別為：152、198～200、328～334、337～344、364～367、396～399、431～434(按N1排序)[9,10]，國(guó)內(nèi)近年也有報(bào)道，認(rèn)為140～157可能是抗原決定簇位點(diǎn)[11]。本次研究中D151E，N200S，I365T，S366I，I396T和K432E變異位于抗原決定簇區(qū)域內(nèi)，可能會(huì)影響NA蛋白的抗原性。

2.5 糖基化位點(diǎn)分析 經(jīng)NetNGlyc 1.0 Server分析，本次研究中的大部分甲型H1N1病毒，其NA蛋白上大都具有疫苗株的NA蛋白上具有的8個(gè)糖基化位點(diǎn)，即分別位于50、58、63、68、88、146、235和386的糖基化位點(diǎn)。除此以外，2011年有10株(10/19)，2013年有16株(16/16)，2016年有8株(8/8)病毒的NA蛋白，由于發(fā)生了N44S的氨基酸殘基改變，從42位起形成了NQS的結(jié)構(gòu)，從而使在NA蛋白上增加了位于42位的糖基化位點(diǎn)(圖3)。而2011年有9株(9/19)，2013年有5株(5/16)，2016年有8株(8/8)毒株，由于發(fā)生了N386S/K的氨基酸殘基改變，因而丟失了386位的糖基化位點(diǎn)。

注：“□”：潛在糖基化位點(diǎn);“Ca”:疫苗株A/California/07/2009(H1N1);“14”:“A/重慶巴南/SWL178/2011(H1)”;“28”:“A/重慶巴南/SWL1677/2013(H1)”;“38”:“A/重慶渝中/SWL310/2016(H1)”圖3 疫苗株與3個(gè)病毒分離株NA基因編碼氨基酸序列對(duì)比Note:“□”： Potential glycosylation sites; “Ca”: A/California/07/2009(H1N1); “14”：A/ChongqingBN/SWL178/2011(H1);“28”：A/ChongqingBN /SWL1677/2013(H1); “38”:“A/ChongqingYZ /SWL310/2016(H1)Fig.3 Comparison of amino acid residues of NA protein between the vaccine strain and three isolated viruses

3 討論

2009年暴發(fā)于墨西哥、美國(guó)的新型甲型流感，其病原為重組新型流感病毒[12]，該病毒2009年6月進(jìn)入重慶并本土化[13,14]。2011開始至2016年6月，甲型H1N1流感病毒在重慶出現(xiàn)兩次流行高峰。本研究對(duì)2011—2016年兩次流行高峰期內(nèi)分離的43株甲型H1N1流感病毒的NA 基因進(jìn)行序列測(cè)定，與WHO推薦的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)對(duì)比，進(jìn)行了進(jìn)化特征、同源性及相關(guān)功能位點(diǎn)分析。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，重慶分離株和國(guó)內(nèi)不同年度分離的毒株間存在的年代差異大于地域差異，毒株分離年代相隔越遠(yuǎn)，毒株親緣差異越大。核苷酸和氨基酸變異情況對(duì)比顯示，43株病毒NA基因同源性不低于96.8%，氨基酸同源性不低于95.8%；與疫苗株核苷酸同源性在97.9%以上，氨基酸同源性在96.8%以上，但總體說來所有毒株之間同源性均較高。

本次研究中甲型H1N1流感病毒氨基酸位點(diǎn)變異隨著年份增加，出現(xiàn)了舊的變異位點(diǎn)消失，新的變異位點(diǎn)增加，且持續(xù)存在的變異位點(diǎn)的變異頻率也在改變。但是總體上來說，隨著年份的增加，所有分離毒株均出現(xiàn)變異位點(diǎn)數(shù)量增加，這說明因氨基酸序列改變而發(fā)生的抗原性變化逐年積累的可能性較大。

糖基化在穩(wěn)定蛋白的三維結(jié)構(gòu)和其被水解以及阻礙抗體的識(shí)別中起到重要作用。糖基化位點(diǎn)的改變或增減會(huì)對(duì)病毒的抗原性和生物特性帶來一定的影響；特別是當(dāng)糖基化位點(diǎn)的改變發(fā)生在抗原決定簇時(shí)，可能會(huì)造成病毒抗原性改變[15,16]。本次研究中的大部分甲型H1N1病毒株和疫苗株一樣，在NA蛋白上具有8個(gè)穩(wěn)定的糖基化位點(diǎn)；并且部分分離的毒株增加了位于42位的糖基化位點(diǎn)，或者丟失了位于386位的糖基化位點(diǎn)。相較于疫苗株，糖基化位點(diǎn)未發(fā)生較大的改變。這也和山東[17]、南京[18]等分離到的甲型H1N1流感病毒的情況相同。

NA 蛋白是流感病毒包膜上一種重要的糖蛋白，能水解唾液酸，防止成熟病毒自身凝集，促使新產(chǎn)生的病毒顆粒從感染細(xì)胞釋放，是目前NA抑制劑的重要作用靶點(diǎn)。本研究選擇的43株甲型H1N1流感病毒，除了A/重慶渝中/SWL11297/2013(H1)出現(xiàn)D151E變異和A/重慶巴南/SWL1677/2013(H1)出現(xiàn)H275Y變異外，其余病毒NA蛋白酶催化活性位點(diǎn)和輔助位點(diǎn)均未發(fā)生改變。D151E位于酶催化活性位點(diǎn)，其改變可能會(huì)影響病毒對(duì)藥物的敏感性，需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。而H275Y的氨基酸突變已被證實(shí)會(huì)產(chǎn)生達(dá)菲耐藥[7,8,19]，可對(duì)上述兩株病毒再進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。

綜上所述，本次研究提示，2011—2016年重慶市甲型H1N1流感病毒與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比，變異程度在逐年積累，但總體上甲型H1N1流行株與疫苗株仍保持較高的同源性，普遍對(duì)達(dá)菲敏感。但隨著時(shí)間推移，相對(duì)于疫苗株，2013年和2016年的甲型H1N1病毒已經(jīng)積累了更多的變異，提示應(yīng)當(dāng)持續(xù)監(jiān)測(cè)甲型H1N1流感病毒，加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測(cè)，可以及時(shí)準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)抗原漂移株與耐藥株，掌握甲型H1N1流感病毒的流行與進(jìn)化規(guī)律，預(yù)測(cè)其發(fā)生發(fā)展情況，為制定應(yīng)對(duì)甲型H1N1流感流行措施提供參考，為科學(xué)有序地防控甲型H1N1流感提供依據(jù)。

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(本文編輯：呂新軍)

Analysis of NA gene variation of influenza A(H1N1) virus isolated in Chongqing from 2011 to 2016

ChenShuang,YeSheng,LingHua,YuZhen,TangYun

DepartmentofMicrobeDetection,ChongqingCenterforDiseaseControlandPrevention,Chongqing400042,China

YeSheng,Email:infcqcdc@163.com

Objective To research the gene characteristics of neuraminidase(NA) gene of influenza A(H1N1) virus of Chongqing from 2011 to 2016. Methods Forty-three H1N1 influenza virus strains isolated from 2011 to 2016 were chosen according to the different time and places of isolation. NA genetic sections were amplified by RT-PCR and sequenced, and then the sequences of nucleic and amino acid were analyzed. Results Phylogenetic analysis indicated that the relationship between H1N1 viruses from 2011 to 2016 and the vaccine strain was close to each other. Compared with the vaccine strain A/California/07/2009(H1N1), the homologies in nucleotide and amino acid sequences for NA gene were 97.9%-99.4% and 96.8%-98.9%, respectively. Most of the strains had the same eight potential glycosylation sites as the vaccine strains, and some strains got new potential glycosylation sites at NA protein site 42, while some lost their potential glycosylation sites at NA protein site 386. Conclusions The changes of H1N1 NA gene had increased year by year, but H1N1 viruses in Chongqing area were still sensitive to Daffy. And monitoring the drug resistant viruses should be strengthened, in order to provide measures against H1N1 viruses.

H1N1; Influenza Virus; Sequence analysis; NA gene

葉盛，Email: infcqcdc@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.003

甲型H1N1；流感病毒；序列分析；NA基因

2016-1 1-22)