周文亭 王鋒 黃昌紅 趙守軍 張勇 畢勝利 曹經瑗

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學病毒和病毒病重點實驗室(周文亭、王鋒、張勇、畢勝利、曹經瑗)；475000開封，河南省開封市疾病預防控制中心(黃昌紅)；Department of Radiology, University of California, San Francisco 94143, USA(趙守軍)

·技術方法·

Abbott公司HAVAb2.0和HAV-IgG試劑的評價

周文亭 王鋒 黃昌紅 趙守軍 張勇 畢勝利 曹經瑗

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 衛(wèi)生部醫(yī)學病毒和病毒病重點實驗室(周文亭、王鋒、張勇、畢勝利、曹經瑗)；475000開封，河南省開封市疾病預防控制中心(黃昌紅)；Department of Radiology, University of California, San Francisco 94143, USA(趙守軍)

目的 比較Abbott公司的兩種抗甲型肝炎(甲肝)病毒(HAV)抗體檢測試劑的性能，為甲肝抗體檢測試劑的選擇提供參考。方法 用兩種試劑將倍比稀釋的標準品平行檢測4遍后，用logistic回歸擬合標準曲線，并計算兩試劑的組內相關系數(shù)(Interclass correlation coefficient, ICC)。選取120份甲肝抗體水平在不同濃度的參比血清用兩種方法平行檢測，計算靈敏度和特異度、及受試者工作特征(Receive operation characteristic, ROC)曲線下面積(Area under curve, AUC)。 結果 HAV-IgG擬合標準曲線的R2值和ICC為0.9977和0.999，略高于HAVAb2.0試劑的0.9893和0.995(P>0.05).以HAV-IgG作為金標準，計算HAVAb2.0的靈敏度和特異度分別為93.15%和100%，AUC為0.994。 結論 試劑HAV-IgG與HAVAb2.0差異很小，均為良好的甲肝抗體檢測試劑。

Fund programs: National High-tech R&D Program of China (863 Program) (2011AA02A114)

甲型肝炎病毒(Hepatitits A Virus, HAV)是經口傳播的病毒[1]，在國內外均有過流行和暴發(fā)流行的報道[2, 3]，血清學檢測是判斷其抗體水平的主要方法。通常在HAV感染1周后，Anti-HAV IgM抗體迅速產生，并持續(xù)數(shù)月。Anti-HAV IgG在感染兩周后產生，可持續(xù)終生[4]。Abbott(美國)公司的HAVAb2.0是檢測甲型肝炎抗體水平的常用試劑，用競爭抑制法同時檢測Anti-HAV IgM和IgG。近年來，Abbott公司推出了新的試劑HAV-IgG，。為了確保研究結果的可信，以及增強前后兩種試劑檢測結果的可比性，我們對該兩種試劑進行了評價比較。

1 材料與方法

1.1 標準品 甲肝總抗體標準品由中國食品藥品檢定研究院惠贈, Anti-HAV總抗體初始濃度為70 IU/ml。

1.2 樣品 選取購自北京市血液中心的117份血清樣品。3份為醫(yī)院提供的甲型病毒性肝炎的患者血清。

1.3 試劑和儀器 Abbott公司(美國)生產的HAVAb2.0，試劑批號為10266LF00，配套儀器為Axsym Plus型全自動酶免分析儀Abbott公司生產的ARCHITECT HAVAb-IgG(批號為258156200)，配套儀器ARCHITECH i2000。

1.4 標準品稀釋及檢測 用Abbott公司生產的“Anti-HAV線性稀釋液”將Anti-HAV抗體標準品用倍比稀釋的方法稀釋成1944、972、486、243、122、61、30、15、8、4和2 mIU/ml 11個濃度梯度，用兩種試劑平行檢測4遍。

1.5 樣本檢測 將120份血清樣本分別用Abbott HAVAb2.0和HAVAb-IgG檢測。使用儀器、試劑及檢測方法嚴格按照各自的說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 用Microsoft Office Access和Excel存儲整理數(shù)據(jù)，使用統(tǒng)計分析系統(tǒng)(Statistics Analysis System, SAS)(V9.2)擬合標準曲線，利用該計算結果用R(i386 3.1.2)進行繪圖。利用IBM SPSS Statistics 20計算ICC，作ROC曲線并計算曲線下面積。

2 結果

2.1 標準曲線 HAV-IgG試劑擬合標準曲線的決定系數(shù)(R2)值(0.9977)略高于HAVAb2.0試劑的R2(0.9893)。數(shù)據(jù)導入到R中，繪制標準曲線圖。從圖1中可看出HAV-IgG的測量平均值落到95%CI里的比HAVAb2.0多，logistic曲線擬合誤差較小。將臨界值代入標準曲線方程可知HAV-IgG的檢測限為14.99 mIU/ml，HAVAb2.0的檢測限為15.52 mIU/ml?？芍狧AV-IgG的敏感性略優(yōu)于HAVAb2.0.

圖1 HAVAb2.0和HAV-IgG的標準曲線Fig.1 Standard curves for HAVAb2.0 and HAV-IgG

120份血清樣本經Abbott HAVAbIgG利用此標準曲線定量后，有73份陽性，其中抗體濃度>10000毫國際單位/毫升(mIU/ml)的參比品25份，500～10000 mIU/ml的7份，100～500 mIU/ml的37份，<100 mIU/ml的4份；陰性47份。參比品包含各濃度樣品，選取較為合理。

2.2 可靠性評價 對HAVAb2.0和HAV-IgG兩種試劑重復檢測標準品的結果用SPSS計算組內相關系數(shù)ICC，HAV-IgG和HAVAb2.0的ICC都大于0.99，兩試劑都具有良好的一致性。HAV-IgG的ICC較高于HAVAb2.0, 分別為0.999[95%置信區(qū)間(95% confidence interval，CI)為0.996-1.000]和0.995(95%CI為0.990-0.998)。

2.3 靈敏度與特異度 120份血清的檢測結果整理為4格表(表1)，有5份血清HAV-IgG檢測為陽性而HAVAb檢測為陰性。將HAV-IgG假定為金標準計算HAVAb2.0的靈敏度和特異度分別為93.15%和100%。且兩個試劑檢測結果不一致的五份血清檢測結果均在臨界值附近。HAV-IgG的檢測敏感性略高于HAVAb2.0。

表1 兩試劑檢測樣本結果Tab.1 Results of samples detected by two kits

2.4 ROC曲線 以HAV-IgG的定性結果作為金標準，將HAVAb2.0檢測得到的CO/S值取倒數(shù)后作ROC曲線(圖2)，并計算得到曲線下面積為0.994. AUC>0.99,說明兩試劑診斷真實性差異很小。

圖2 HAVAb2.0試劑ROC曲線Fig.2 Receive operation characteristic of HAVAb2.0

3 討論

選擇一種好的檢測試劑對于得到可信的甲肝抗體檢測結果甚為重要。Abbott HAVAb2.0是一種廣泛使用的一種試劑，目前該公司又推出了新一代試劑HAV-IgG，我們對這兩種試劑從標準曲線擬合能力、可靠性和真實性3個方面進行評價，以增強兩種試劑檢測結果的可比性。

擬合標準曲線是定量測定時必須的步驟，標準曲線擬合優(yōu)度直接關系到定量的準確性。越接近1則說明擬合效果越好，穩(wěn)定性和真實性分別用ICC和靈敏度、特異度、ROC曲線作為評價指標。ICC指樣品間變異占總變異的比例，越接近于1則穩(wěn)定性越好[6-9]。在真實性即準確性評價中，相較靈敏度、ROC則包含了所有截斷值下的靈敏度和特異度，使得評價更為全面客觀。ROC曲線下面積>0.9則該方法準確性較高[10-12]。

另外，在真實性評價時需要選擇當前公認的診斷該疾病最可靠、準確的方法作為“金標準”。因為HAV的臨床診斷常依靠血清學檢測[4]，又常以Abbott公司的試劑作為標準，在對它前后兩代產品進行比較時，我們就選擇了以新的試劑作為標準。因為缺乏絕對的“金標準”，本研究中真實性比較結果的差異也只能說明兩試劑間的差異。

本研究的兩種試劑，用logistic回歸擬合標準曲線，HAV-IgG的R2值略高于HAVAb2.0, HAV-IgG試劑的檢測下限略低，HAV-IgG試劑的測量穩(wěn)定性也有較好的表現(xiàn)。在真實性評價中，HAV-IgG的靈敏度高于HAVAb2.0, 特異度沒有差別。

在本研究中，HAV-IgG表現(xiàn)出略高的靈敏度和穩(wěn)定性，從原理上分析，也符合間接法比競爭抑制法檢測靈敏度高穩(wěn)定性好的一般規(guī)律。競爭抑制法是當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時常用的方法，其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多,結合在固相上的酶標抗體愈少,因此陽性反應呈色淺于陰性反應。這種方法檢測穩(wěn)定性較差，靈敏度相對不足。間接法是利用酶標記的抗抗體檢測已與固相上的抗原結合的受檢抗體[13]，是一種更加靈敏且穩(wěn)定的方法。

需要注意兩種試劑的檢測范圍不完全相同。HAV-IgG用間接法的原理僅僅檢測IgG抗體，而HAVAb2.0用競爭抑制法原理同時檢測IgG和IgM抗體。我們的檢測樣本中有21份anti-HAV IgM為陽性(用萬泰抗甲型肝炎IgM檢測試劑盒檢測)(包括來自醫(yī)院甲型肝炎住院患者的3份血清)，而HAV-IgG和HAVAb2.0檢測結果也均為陽性。說明在這些血清中，同時有Anti-HAV IgM和IgG。這是因為在HAV感染的病程中，IgM單獨陽性的時間非常短，只有一周左右[4]。除非在此一周內采血，否則對抗體檢測結果影響很小。

綜上所述，Abbott公司HAV-IgG與HAVAb2.0的差異很小，均為良好的甲肝抗體檢測試劑。

聲明：本文無任何相關利益沖突。

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(本文編輯：陳培莉)

Comparisons for kits HAVAb2.0 and HAV-IgG

ZhouWenting,WangFeng,HuangChanghong,ZhaoShoujun,ZhangYong,BiShengli,CaoJingyuan

KeyLaboratoryforMedicalVirology,MinstryofHealth,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing10026,China(ZhouWT,WangF,ZhangY,BiSL,CaoJY);Kaifengcenterfordiseasecontrolandprevention,Henanprovince，Kaifeng475000,China(HuangCH);DepartmentofRadiology,UniversityofCalifornia,SanFrancisco94143,USA(ZhaoSJ)Correspondingauthor:CAOJingyuan,Email:caojy@126.com

Objective Two kits for detecting anti-HAV antibody produced by Abbott Laboratories are evaluated for their performance in order to use in the anti-HAV antibodies detections. Methods Serially diluted standard reference serum were detected 4 times with HAVAb2.0 kit and HAV-IgG kit , then fit standard curves and calculated Interclass correlation coefficient (ICC). 120 serum that have different levels of anti-HAV antibodies were chosen to be detected by two kits and calculated sensitivity and specificity, receive operation characteristic (ROC) curve and area under curve (AUC) while the results of HAV-IgG were used as golden standard. Results R2and ICC for HAV-IgG were 0.9977 and 0.999, respectively, higher than 0.9893 and 0.995(P>0.05) for HAVAb2.0. Sensitivity and specificity for HAVAb2.0 were 93.15% and 100% and AUC was 0.994 when kit HAV-IgG was chosen as golden standard. Conclusion There is little difference in performance between HAV-IgG and HAVAb2.0, both of them can be used in anti-HAV antibodies detection.

Antibodies to hepatitis A virus; Diagnostic test; Reliability; Validity

曹經瑗，Email: caojy@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.019

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2011AA02A114)

抗甲型肝炎病毒抗體；診斷試劑；穩(wěn)定性；真實性

2016-01-07)