管茜茜 趙莉 任皎 黃盼盼 王慧娟 陳迎珠 朱娜 譚文杰 阮力 田厚文

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

·技術(shù)方法·

猴痘病毒特異性單克隆抗體制備及鑒定

管茜茜 趙莉 任皎 黃盼盼 王慧娟 陳迎珠 朱娜 譚文杰 阮力 田厚文

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

目的 制備猴痘病毒特異性單克隆抗體，建立猴痘病毒免疫熒光檢測方法。方法 原核表達(dá)猴痘病毒A29蛋白及與之同源的痘苗病毒A27蛋白和牛痘病毒162蛋白，建立抗體篩選系統(tǒng)；使用人工合成的猴痘病毒A2917～49多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾細(xì)胞通過融合、克隆和篩選等制備猴痘病毒單克隆抗體。通過ELISA法確定單克隆抗體的特異性及亞型。結(jié)果 在大腸埃希菌中成功表達(dá)A29、A27及162蛋白，經(jīng)Western blot鑒定分子量與預(yù)期相符，帶his標(biāo)簽的三種蛋白經(jīng)His-Bind親和層析柱純化后純度均大于90%；用純化蛋白篩選獲得8株A29蛋白特異的單克隆抗體，其中兩株為IgG3型，其余為IgG1型。結(jié)論 本研究獲得8株猴痘病毒特異性單克隆抗體，為進(jìn)一步建立猴痘病毒免疫熒光檢測奠定基礎(chǔ)。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China(2013ZX10004001,2013ZX0004101);National Key Research and Development Program(2016YFC1200900)

目前已知可致人發(fā)病的正痘病毒主要有天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒及猴痘病毒。猴痘病毒是動物源性病毒，在人類中可引起類似天花的病癥，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱出疹后結(jié)痂。該病于1970年初次在人類中發(fā)現(xiàn)，主要見于中西非熱帶雨林地區(qū)[1]，但疫區(qū)在擴(kuò)大，特別是2003年美國暴發(fā)猴痘[2]，引起人們對這種病毒的警覺。此病毒可被利用于制造生化武器，威脅人類安全。因此，建立正確診斷猴痘病毒的方法，才能制定相關(guān)措施政策，控制其可能造成的危害。PCR是目前國內(nèi)外主要檢測方法[3]，但需要依賴設(shè)備和敏感的樣本。我國尚未建立除PCR檢測法的其他診斷方法。而建立猴痘病毒特異的免疫學(xué)檢測法可以為我國應(yīng)對可能出現(xiàn)的猴痘疫情以及生物反恐提供應(yīng)急技術(shù)儲備。

猴痘病毒基因組由大小約為196 kb的雙股正鏈DNA組成，與其他正痘病毒基因組同源性高。我國目前雖無猴痘輸入性病例，可借鑒國外猴痘病毒研究成果。Roumillat等[4]利用猴痘病毒制備的一株猴痘病毒特異單克隆抗體mAb 69-126-3-7，只與猴痘病毒反應(yīng)，與痘苗、天花、牛痘、駱駝痘病毒均不反應(yīng)。Hughes等[5]發(fā)現(xiàn)其表位在猴痘病毒A29蛋白的A2917～49多肽上。本研究篩選出8株只與猴痘病毒A29蛋白反應(yīng)的抗體，即猴痘病毒特異性單克隆抗體。這是國內(nèi)首次制備出猴痘病毒特異性單克隆抗體的研究，為后期建立猴痘病毒免疫熒光檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸埃希菌BL21(DE3)感受肽細(xì)胞(北京全式金公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)；HAT培養(yǎng)基(美國Gibco)；HT培養(yǎng)基(Gibco)；聚乙二醇1450(美國Sigma)；青-鏈霉素(美國Gibco)；抗體亞型鑒定試劑盒(Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit)；BALB/c小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心)；His鎳柱(美國GE公司)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)和Image Lab分析軟件(美國Bio-rad公司)。

1.2 多肽合成與蛋白偶聯(lián) A2917～49多肽 (TEFFSTKAAKNPETKREAIVKAYGDDNEETLKQ )，由北京中科亞光生物科技有限公司合成20 mg，其中10 mg與匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)。

1.3 基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建 從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫下載猴痘病毒A29基因序列(330 bp)、痘苗病毒A27基因序列(330 bp)、牛痘病毒162基因序列(330 bp)，基因尾部加入6個his編碼基因[6]。表達(dá)載體選擇pET9a質(zhì)粒(4 341 bp)。酶切位點(diǎn)選擇質(zhì)粒上NdeI與BamHI酶切位點(diǎn)。由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成后插入pET9a載體中，三種重組質(zhì)粒命名為pET9a-mpxvA29、pET9a-vacvA27、pET9a-cpxv162。對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 蛋白表達(dá)與鑒定 將質(zhì)粒pET9a-mpxvA29、pET9a-vacvA27、pET9a-cpxv162分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受肽細(xì)胞，挑選陽性克隆接種于3 ml含50 μg/ml 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜；第二天再按1∶100接種于含50 μg/ml 卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，240 rpm，振蕩培養(yǎng)3 h至OD值達(dá)0.8左右加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h,收獲菌液。分別取200 μl上述菌液，4000 rpm,離心2 min,再分別以80 μl雙蒸水充分重懸后與20 μl的5X loading buffer混勻，煮沸5 min, 取樣10 μl。以5%濃縮膠和15%分離膠進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE鑒定。同時對表達(dá)的蛋白作Western blot鑒定。

1.5 蛋白純化與鑒定 各取上述300 ml菌液,4 000 rpm,離心30 min，棄上清，以30 ml PBS重懸，在冰浴中超聲破碎菌體，功率為200 w,超聲4 s,間隔4 s,工作140次，至外觀澄清透亮。離心后上清經(jīng)His-Bind柱親和層析純化。

1.6 動物免疫 選擇8周齡雌性BALB/c小鼠，分別于第1、21及35天對小鼠進(jìn)行皮下注射免疫：首次免疫使用A2917～49多肽-KLH與完全弗氏佐劑1∶1乳化后，皮下注射,劑量為100 μg/只；第二次免疫使用A2917～49多肽-KLH與不完全弗氏佐劑1∶1乳化，皮下注射，劑量同上；第三次免疫使用A2917～49多肽-KLH皮下注射，劑量同上；融合前3 d腹腔注射加強(qiáng)免疫，劑量為50 μg/只。

1.7 細(xì)胞融合與克隆 取1 ml聚乙二醇1450逐滴加入到5∶1混合的免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞中，60 s內(nèi)加完；37℃水浴靜置5 min，然后在1 min內(nèi)逐滴加完1 ml無血清的DMEM培養(yǎng)液，同時不斷攪動細(xì)胞，重復(fù)一次；然后3 min內(nèi)逐滴加入7 ml無血清的DMEM培養(yǎng)液。離心后去上清。用含HAT和20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成1×106個脾細(xì)胞/ml，接種到5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。10 d后使用間接法ELISA篩選IgG抗體陽性的融合孔，選擇陽性孔進(jìn)行克?。簩⑷诤峡字械募?xì)胞充分混勻，取100 μl使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板2倍稀釋7個稀釋度。顯微鏡下計數(shù)為50左右的細(xì)胞孔將其回收，使用培養(yǎng)液稀釋成10 ml，充分混勻后加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔。

1.8 陽性單克隆細(xì)胞株抗體亞型鑒定 對克隆后檢測為陽性的單克隆細(xì)胞株收集上清使用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit進(jìn)行抗體亞型鑒定。

2 結(jié)果

2.1 A29、A27和162蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定 用限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI對三質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，重組質(zhì)粒分別在約4.3 kb與330 bp出現(xiàn)明顯的條帶，大小與預(yù)期一致。進(jìn)一步測序結(jié)果無誤。

2.2 蛋白表達(dá)與鑒定 將三質(zhì)粒pET9a-mpxvA29、pET9a-vacvA27、pET9a-cpxv162分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)2 h后，在相對分子質(zhì)量約14×103處可見明顯條帶(圖1A),與預(yù)期大小一致。蛋白經(jīng)Western blot檢測，顯示在相對分子量約14×103處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)，說明該條帶是特異的目的蛋白表達(dá)帶。

M:marker；1：162蛋白純化前原液；2: 162蛋白20 mmol/L咪唑洗脫液；3：162蛋白300 mmol/L咪唑洗脫液圖2 162蛋白純化SDS-PAGE分析及Image Lab軟件純度分析M: marker; 1: supernatant before 162 protein purification; 2: 20 mmol/L imidazole eluent of 162 protein; 3: 300 mmol/L imidazole eluent of 162 protein. Fig.2 SDS-PAGE analysis and Image Lab results of protein 162 purification

A, M:marker;1:空載體;2：誘導(dǎo)前pET9a-mpxvA29全菌；3-5:誘導(dǎo)后pET9a-mpxvA29、 pET9a-vacvA27、pET9a-cpxv162全菌;B, M: marker;1:空載體;2-4:誘導(dǎo)后pET9a-mpxvA29、pET9a-vacvA27、pET9a-cpxv162全菌圖1 A29、A27和162蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析及Western blot鑒定A, M: marker; 1:E.coli lysate of empty plasmid vector; 2:E.coli lysate of pET9a- mpxvA29; 3-5: E.coli lysate of pET9a-mpxvA29,pET9a-vacvA27, pET9a-cpxv162 after induced for 2 h;B, M: marker;1:E.coli lysate of empty plasmid vector; 2-4: E.coli lysate of pET9a-mpxvA29,pET9a-vacvA27, pET9a-cpxv162 after induced for 2 hFig.1 SDS-PAGE analysis and Western blot results of protein A29,A27 and 162 expression

2.3 蛋白純化與鑒定 三組表達(dá)產(chǎn)物超聲破碎后，經(jīng)His-Bind柱親和層析純化，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定分析，得到A29蛋白純度為90.6%、A27蛋白純度為93.8%及162蛋白純度為96.1% (圖2中只包括162蛋白純化結(jié)果，其余結(jié)果未顯示)。2.4 細(xì)胞克隆及陽性單克隆抗體細(xì)胞株的篩檢 使用PEG1450融合免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，第4天觀察融合細(xì)胞，融合率為94%。經(jīng)過間接法ELISA篩選后，獲得31個陽性的融合細(xì)胞孔。為得到A29蛋白抗體特異陽性的單克隆細(xì)胞株，挑選7個陽性融合細(xì)胞孔進(jìn)行一次性克隆，獲得88個單克隆細(xì)胞株，再經(jīng)過ELISA篩檢后，有8個單克隆細(xì)胞株上清與A29蛋白反應(yīng)，在450 nm波長處吸光度值均為2.0以上,與陰性對照吸光度值0.08比較，判定為陽性反應(yīng)，而與A27蛋白及162蛋白反應(yīng)孔的吸光度值均在0.10以下，判定為陰性反應(yīng)，即得到8株A29蛋白特異的單克隆細(xì)胞株。

2.5 陽性單克隆細(xì)胞株抗體亞型鑒定 對此8株單克隆細(xì)胞株收集上清進(jìn)行抗體亞型鑒定，在450 nm波長處測定每孔吸光度，結(jié)果顯示兩株為IgG3型，其余為IgG1型(表1)。

表1 單克隆抗體亞型鑒定

3 討論

2016年8—10月，中非共和國報道了26例猴痘患者，其中2例患者死亡[7]，2017年3月，剛果(布)地區(qū)暴發(fā)20例猴痘病例，死亡3例。說明猴痘病毒在疫區(qū)依然活躍。目前我國雖無猴痘輸入性病例，但在中西非的勞務(wù)及援外人員數(shù)以千計，且經(jīng)常往返，隨時有病例輸入的可能性。鑒于目前國內(nèi)尚無猴痘特異的免疫學(xué)檢測技術(shù)，可借鑒國外研究在我國建立相關(guān)技術(shù)。

Roumillat等[4]證明篩選到的猴痘病毒特異性單克隆抗體mAb 69-126-3-7的表位在A2917～49多肽序列上，且為線性表位。由此我們推測此段多肽也可能是猴痘特異性抗原。然而我們通過ELISA實(shí)驗(yàn)將之與痘苗病毒小鼠血清反應(yīng)，結(jié)果顯示該多肽能與痘苗抗體結(jié)合，說明為非猴痘特異性的抗原肽。

猴痘病毒A29蛋白和痘苗病毒A27蛋白、牛痘病毒162蛋白，同源性均為95%。盡管如此，由于A2917～49多肽全長33個氨基酸，其中含有猴痘病毒特異性抗體表位，因此我們可以采用人工合成的A2917～49多肽免疫小鼠，通過脾細(xì)胞融合，采用A29蛋白及與之同源的其他正痘病毒蛋白進(jìn)行篩選，就有可能獲得猴痘病毒特異性單抗。為增強(qiáng)肽段的免疫原性，我們將多肽偶聯(lián)KLH蛋白后，經(jīng)兩針免疫小鼠后，針對A2917～49多肽抗體滴度可達(dá)1∶50 000。由于天花病毒基因操作受WHO天花消滅的相關(guān)生物安全規(guī)定，不能進(jìn)行天花病毒基因合成，因此本研究中無法使用天花蛋白進(jìn)行篩選。此外通過原核表達(dá)的猴痘A29蛋白及與之同源的其他正痘病毒蛋白進(jìn)行猴痘特異的單克隆抗體篩選，獲得的單克隆抗體理論上應(yīng)當(dāng)與猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒、牛痘病毒等進(jìn)行反應(yīng)做進(jìn)一步驗(yàn)證，由于條件限制，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室尚無猴痘、天花、牛痘病毒，因此我們僅用痘苗病毒通過ELISA實(shí)驗(yàn)與篩選獲得的猴痘特異單抗進(jìn)行了反應(yīng)，結(jié)果表明猴痘特異的單抗與痘苗病毒無結(jié)合，初步證明了實(shí)驗(yàn)篩選獲得的單抗的特異性。

本研究用猴痘A29蛋白上的A2917～49多肽免疫小鼠，獲得了猴痘病毒特異性單抗，為建立猴痘病毒特異的免疫熒光檢測方法奠定了基礎(chǔ)，對我國應(yīng)對可能出現(xiàn)的猴痘疫情以及生物反恐都具有現(xiàn)實(shí)意義。

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[7] Monkeypox fact sheets (November 2016). World Health Organization. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs161/en/.

(本文編輯：唐瀏英)

Generation and characterization of specific monoclonal antibodies against monkeypox virus

GuanQianqian,ZhaoLi,RenJiao,HuangPanpan,WangHuijuan,ChenYingzhu,ZhuNa,TanWenjie,RuanLi,TianHouwen

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

TianHouwen,Email:houwent@126.com.

Objective To generate monkeypox virus specific monoclonal antibodies for further establishing monkeypox virus immunofluorescence assay. Methods Monkeypox virus A29 protein, vaccinia ortholog A27 protein and cowpox ortholog 162 protein were expressed inE.coliBL21 to screen antibodies. Synthetic monkeypox virus A2917 ～ 49polypeptide was used to immune BALB/c mice. Monkeypox virus monoclonal antibodies were generated through fusion, cloning and screening techniques. Indirect ELISA was performed to test antibodies specificity and subtype. Results A29, A27 and 162 proteins were highly expressed inE.coliand detected by Western blot. The three his-tagged proteins were purified using His-Bind affinity chromatography column. The purity of the proteins was all more than 90%. And 8 strains monkeypox virus specific monoclonal antibodies were screened by the three purified proteins. Two mAbs of 8 were IgG3 subtype and the rest were IgG1 subtype. Conclusions Eight strains of monkeypox virus specific monoclonal antibodies were generated, they can be used to further establish monkeypox virus immune immunofluorescence assay.

Monkeypox virus;A29 protein;Polypeptide;Monoclonal antibody

田厚文,Email:houwent@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.015

國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX10004001，2013ZX0004101)；國家科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2016YFC1200900)

猴痘病毒；A29蛋白；多肽；單克隆抗體

2016-12-29)