張艷晶 韓連連 郭麗 鐘輝 王健偉

100730 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

·技術(shù)方法·

可誘導(dǎo)性表達(dá)多種流感病毒HA蛋白穩(wěn)定細(xì)胞系新型構(gòu)建方法的研究

張艷晶 韓連連 郭麗 鐘輝 王健偉

100730 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

目的 建立一條創(chuàng)新性的技術(shù)路線快速構(gòu)建可誘導(dǎo)性表達(dá)多種甲型流感病毒(IAV)HA蛋白的細(xì)胞系。方法 將多種IAV的HA蛋白基因連接到含有PiggyBac轉(zhuǎn)座子位點的Cumate誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞系，利用嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞，并用Cumate誘導(dǎo)相應(yīng)病毒蛋白表達(dá)。 結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測及Western blot檢測結(jié)果均表明，加入誘導(dǎo)劑Cumate后，獲取的細(xì)胞系中絕大部分細(xì)胞均開始表達(dá)相應(yīng)的病毒蛋白。結(jié)論 利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以高效率的構(gòu)建誘導(dǎo)性表達(dá)IVA HA蛋白的細(xì)胞系。

Fund programs: The Peking Union Medical College Youth Research Funds(3332016140)

流感病毒是流行性感冒(簡稱流感)的病原體，由于其抗原性易發(fā)生變異，并可導(dǎo)致傳染性極強的呼吸系統(tǒng)疾病，流感病毒曾多次引起世界性大流行。近年來，禽流感病毒H5N1和H7N9引起了數(shù)百例人感染[1]，相對于季節(jié)性流感，禽流感病毒患者死亡率明顯增高(分別達(dá)60%和36%)[2-4]。因此，迫切需要對禽流感致病機理，特別是包括HA蛋白在內(nèi)的病毒蛋白與致病性的關(guān)系[5]，進(jìn)行深入研究。

研究病毒蛋白與致病性的關(guān)系需要構(gòu)建體外病毒蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。相對于質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)系統(tǒng)，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系具有結(jié)果穩(wěn)定、可觀察長時間作用的特點[6-7]。但經(jīng)典的細(xì)胞系單克隆篩選技術(shù)效率低下，工作強度大且耗時長，因此迫切需要采用新的細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)路線。已有研究表明，利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以顯著提高外源性DNA整合效率[8]，從而顯著增加病毒蛋白表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建效率。因此，在本研究中，我們將采用PiggyBac轉(zhuǎn)座子技術(shù)構(gòu)建包括禽流感在內(nèi)的多種流感病毒HA蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。

由于部分病毒蛋白具有細(xì)胞毒性，因此在本研究中將采用異丙基苯甲酸(4-isopropylbenzoic acid, Cumate) 誘導(dǎo)表達(dá)體系來表達(dá)病毒蛋白。由于四環(huán)素在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，常用的四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)容易受到牛血清中殘留的四環(huán)素影響，因此在四環(huán)素誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中，需要篩選培養(yǎng)用的血清。而Cumate是一種無細(xì)胞毒性、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下缺如的化學(xué)物質(zhì)，在培養(yǎng)基中加入Cumate即可誘導(dǎo)相應(yīng)啟動子表達(dá)其下游基因。因此相對于四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，Cumate誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡便，結(jié)果穩(wěn)定的特點。

在本研究中，我們利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了一系列流感病毒HA蛋白可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系，充分展示了該方法高效、快捷的特點。同時，本研究中構(gòu)建的HA誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系也為研究流感病毒HA蛋白與流感病毒致病性之間的關(guān)系打下了堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞 H3N2、H5N1、H7N7、H7N9和H9N2的HA基因合成于上海生工。293A細(xì)胞購自美國Atcc，培養(yǎng)基為添加有10%胎牛血清、2 mmol/L glutamine (美國Invitrogen公司)、100 U 青鏈霉素(Invitrogen公司)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)。細(xì)胞在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。Cumate誘導(dǎo)PiggyBac轉(zhuǎn)座子表達(dá)系統(tǒng)(PB-Cuo-MCS-IRES-GFP-EF1-CymR-Puro Inducible cDNA Cloning and Expression Vector，貨號PBQM812A-1，簡稱12A)以及PiggyBac轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒(Super PiggyBac Transposase expression vector)均購自Systembio公司，其中12A質(zhì)粒通過IRES帶有GFP表達(dá)框?？寺∮镁闠OP10購自北京Tiangen公司。

1.2 試劑 PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Qiagen公司。DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶和高保真酶均購自美國NEB公司。Cumate購自美國Sigma公司。

1.3 PCR引物設(shè)計和合成 以合成的各型流感病毒的HA基因序列設(shè)計引物，并在表達(dá)框羧基末端加入FLAG標(biāo)簽，以加上FLAG標(biāo)簽的各型HA為模板設(shè)計引物連接到12A質(zhì)粒上。序列如下：5′-3′

H3N2-5:GAGCTAGCGAATTCGAATTTATGAAGACTATCATTGCTCTG

H3N2-3:AAATCGGATCCGCGGCCGTCACTTATCGTCGTCATCCT

H5N1-5:GAGCTAGCGAATTCGAATTTATGGAGAAAATTGTGCTGCTG

H5N1-3:AAATCGGATCCGCGGCCGTTACTTATCGTCGTCATCCT

H7N7-5:GAGCTAGCGAATTCGAATTTATGAACACTCAAATCCTGGTC

H7N7-3:AAATCGGATCCGCGGCCGTTACTTATCGTCGTCATCCT

H7N9-5:GAGCTAGCGAATTCGAATTTATGAATACGCAGATTTTGGTG

H7N9-3:AAATCGGATCCGCGGCCGCTACTTATCGTCGTCATCCTT

H9N2-5:GAGCTAGCGAATTCGAATTTATGGAAATTATTGCCCTGATC

H9N2-3:AAATCGGATCCGCGGCCGTTACTTATCGTCGTCATCCT

1.4 目的基因的PCR擴增 以上海生工合成的HA基因為模版，用高保真酶擴增目的基因。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，52℃退火1 min，68℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后68℃延伸2 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收。

1.5 重組表達(dá)載體的SLIC法構(gòu)建及克隆 將12A質(zhì)粒用SWAⅠ酶切2～3 h，與PCR擴增的目的基因以2：1的比例，加入T4 DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶緩沖液，22℃連接25 min，取出后迅速加入連接體系體積1/10的dCTP(2 mmol/L)，室溫放置5 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌TOP10，在37℃孵育箱中，在1‰氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落活化培養(yǎng)，小提質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR鑒定正確質(zhì)粒送北京睿博測序公司測序。測序正確的菌種進(jìn)行擴大培養(yǎng)，Qiagen中提試劑盒提取質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

1.6 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建 將得到的重組表達(dá)質(zhì)粒與Super Piggybac Transposase質(zhì)粒以0.6:0.2的比例轉(zhuǎn)染24孔板中的293A細(xì)胞。次日將24孔板中轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞傳至6孔板中，待6孔板中細(xì)胞生長至底面積的30%左右，加入終濃度為2 μg/ml的嘌呤霉素。培養(yǎng)2～3 d后，可見大量細(xì)胞漂浮死亡。將存活細(xì)胞從6孔板中細(xì)胞傳至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入終濃度為1 μg/ml的嘌呤霉素，培養(yǎng)2～3 d后，傳至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶后繼續(xù)培養(yǎng)，長滿后鋪24孔板(1×105/孔)用于蛋白表達(dá)鑒定，其余細(xì)胞液氮凍存。

1.7 重組蛋白流式分析 將上述細(xì)胞系傳代入24孔板后加入Cumate(1∶10000，起始濃度300 mg/ml)，培養(yǎng)48 h，胰酶消化收獲細(xì)胞，用含0.5%BSA和2 mmol/L EDTA的PBS洗滌細(xì)胞一次，0.2 ml PBS重懸細(xì)胞，流式檢測GFP的表達(dá)。

1.8 重組蛋白Western blot分析 將上述細(xì)胞系傳代入24孔板后加入Cumate(1∶10000)，培養(yǎng)48 h，用PLB裂解細(xì)胞，收上清，100 μl樣本加入20 μl的6×loading buffer，100℃10 min，制好的蛋白樣本經(jīng)12%SDS-PAGE后，在濕轉(zhuǎn)膜儀上轉(zhuǎn)移至NC膜上，用5%脫脂奶粉37℃封閉30 min或4℃過夜。PBST洗膜3次，加入封閉液稀釋的抗Flag(購自美國Sigma公司，1∶4000)，室溫?fù)u動2 h。PBST洗膜3次，加入封閉液稀釋的兔抗鼠800(購自Invitrogen公司，1∶10 000)，室溫?fù)u動反應(yīng)30 min，PBST洗膜3次，流水沖洗3次，用Odyssey檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在約1700 bp處出現(xiàn)特異性條帶，大小和預(yù)期相符。將目的基因送測序，結(jié)果表明插入片段與各型HA重合率為100%，無突變，插入序列方向正確。該結(jié)果提示利用SLIC連接技術(shù)可以可靠構(gòu)建目的質(zhì)粒。

2.2 重組HA蛋白熒光檢測 將嘌呤霉素篩選過的可誘導(dǎo)表達(dá)HA蛋白細(xì)胞系以1×105/孔鋪入24孔板。培養(yǎng)24 h后加入或不加入Cumate誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后用Nikon熒光顯微鏡觀查熒光，結(jié)果顯示絕大部分細(xì)胞均顯示綠色熒光(圖1)，提示經(jīng)嘌呤霉素篩選后，大部分存活的細(xì)胞均已整合了PiggyBac轉(zhuǎn)座子內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)。圖1中展示了H7N9 HA細(xì)胞系加入Cumate與否對細(xì)胞綠色熒光的影響。

圖1 Cumate誘導(dǎo)H7N9 HA細(xì)胞系綠色熒光表達(dá)Fig.1 Cumate inducea the EGFP expression in H7N9 HA cell line

2.3 重組HA蛋白表達(dá)細(xì)胞系流式細(xì)胞檢測分析 為定量測定該技術(shù)路線嘌呤霉素篩選后細(xì)胞中陽性表達(dá)細(xì)胞的比例，將嘌呤霉素篩選過的可誘導(dǎo)表達(dá)HA蛋白細(xì)胞系以1×105/孔鋪入24孔板。培養(yǎng)24 h后，分別加入或不加入Cumate誘導(dǎo)劑，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光的表達(dá)。結(jié)果顯示80%～90%以上的細(xì)胞均為GFP陽性，該結(jié)果再次提示該技術(shù)路線篩選到的細(xì)胞株具有很高的陽性表達(dá)率。見圖2。

C(-)：未加入Cumate；C(+)：加入Cumate；Vector：12A空載體細(xì)胞系；H3：H3N2 HA蛋白表達(dá)細(xì)胞系圖2 Cumate誘導(dǎo)所獲細(xì)胞系中EGFP表達(dá)C(-)：without Cumate；C(+)：with Cumate；Vector：cell line with empty vector；H3： cell line with H3N2 HA proteinFig.2 Cumate blot induced EGFP expression in cell lines

2.4 重組HA蛋白表達(dá)細(xì)胞系Western blot分析 為最終確定目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，將嘌呤霉素篩選過的可誘導(dǎo)表達(dá)HA蛋白細(xì)胞系以1×105/孔鋪入24孔板。培養(yǎng)24 h后，分別加入或不加入Cumate誘導(dǎo)劑，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，加入100 μl PLB裂解細(xì)胞，按Western blot標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，在加入Cumate誘導(dǎo)劑后，在H3N2、H7N7和H7N9的HA細(xì)胞系中均可觀察到全長HA0的表達(dá)，而在H5N1、H9N2的HA細(xì)胞系中可觀察到HA2的表達(dá)。而在未加入誘導(dǎo)劑的各細(xì)胞系中均未觀察到相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。該實驗結(jié)果證實，加入誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)各細(xì)胞系表達(dá)相應(yīng)的HA蛋白。見圖3。

圖3 重組HA蛋白表達(dá)細(xì)胞系Western Blot分析Fig.3 The Western identification of HA expression in cell lines

2.5 通過控制誘導(dǎo)劑Cumate的濃度可以調(diào)控細(xì)胞中HA蛋白的表達(dá)量 為觀察不同濃度誘導(dǎo)劑對目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響，將H3N2和H7N7 HA蛋白細(xì)胞系以1×105/孔鋪入24孔板.培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的Cumate誘導(dǎo)劑(稀釋倍數(shù)分別：1/10 000,1/20 000,1/40 000,1/60 000,1/80 000,1/100 000；起始濃度300 mg/ml)。誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞，按Western blot標(biāo)準(zhǔn)操作流程檢測相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)劑濃度的增高，目標(biāo)蛋白的表達(dá)量也相應(yīng)增加，兩者存在著良好的相關(guān)性。該結(jié)果提示，通過控制誘導(dǎo)劑Cumate的濃度可以調(diào)控細(xì)胞中HA蛋白的表達(dá)量，為進(jìn)一步的HA蛋白質(zhì)功能比較提供了便利。見圖4。

注：最右側(cè)圖為左側(cè)兩圖條帶灰度定量分析結(jié)果圖4 不同濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)HA蛋白表達(dá)的Western blot分析Note: Two graphs on the right side are the quantitative analysis results in the gray scaleFig.4 The effect of different concentration Cumate on HA expression in cell lines

3 討論

本研究利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子技術(shù)建立了多種流感病毒HA蛋白的可誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系。Western blot檢測結(jié)果表明加入誘導(dǎo)劑Cumate后，HA蛋白可以在相應(yīng)細(xì)胞系中持續(xù)表達(dá)，且其表達(dá)量與誘導(dǎo)劑的濃度直接相關(guān)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選后，80%～90%的存活細(xì)胞均可以誘導(dǎo)出目的蛋白表達(dá)，從而顯示利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以高效率的構(gòu)建外源病毒蛋白表達(dá)細(xì)胞系。

PiggyBac轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)于昆蟲細(xì)胞，但作為一種高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前已被應(yīng)用于多種哺乳動物細(xì)胞中。研究表明其將目的基因整合入細(xì)胞基因組的效率是傳統(tǒng)隨機整合載體的8倍以上[9-11]。因其整合的高效率，絕大多數(shù)經(jīng)過嘌呤霉素篩選過的細(xì)胞均可表達(dá)相應(yīng)目的蛋白，因此經(jīng)典技術(shù)路線中的單克隆篩選過程在PiggyBac技術(shù)路線中通?？梢允÷?。相對于逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺相關(guān)病毒系統(tǒng)，因為省略了病毒生產(chǎn)過程，PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)具有流程短、操作簡便的特點。而相對于已有的Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在插入長基因片段時效率更高，而且沒有Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的Overproduction inhibition效應(yīng)(一種由于轉(zhuǎn)座酶高表達(dá)反而導(dǎo)致轉(zhuǎn)座效率低下的效應(yīng))，因此是一種更為優(yōu)異的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)[12]。

在研究病毒蛋白活性的研究手段中，瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)具有構(gòu)建時間短，操作簡單的特點。但是其效率與細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率等密切相關(guān)，難以應(yīng)用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞。而且轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率與細(xì)胞狀態(tài)直接相關(guān)，因此其結(jié)果穩(wěn)定性也相對較差。同時，瞬時轉(zhuǎn)染的外源基因僅能持續(xù)表達(dá)很短的一段時間，因此難以用于觀察目的蛋白的長時間作用。在本研究中，我們采用了誘導(dǎo)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系技術(shù)路線，目的蛋白在正常培養(yǎng)過程中不表達(dá)，因此不會干擾細(xì)胞的正常狀態(tài)，從而避免了病毒細(xì)胞毒性蛋白對細(xì)胞系傳代的影響。加入誘導(dǎo)劑后，目的蛋白開始表達(dá)，以未加誘導(dǎo)劑的相應(yīng)細(xì)胞系為對照，即可觀察相應(yīng)目的蛋白的活性。而且，由于目的蛋白的表達(dá)量與誘導(dǎo)劑的濃度高度相關(guān)，因此可以通過調(diào)節(jié)誘導(dǎo)劑的濃度來觀察目的蛋白表達(dá)量與其活性的關(guān)系，從而為進(jìn)一步確認(rèn)其生物活性提供依據(jù)。

此外，在本研究中我們還采用了的SLIC連接方法構(gòu)建目標(biāo)質(zhì)粒。SLIC是一種非序列依賴及非DNA連接酶依賴的分子克隆方法[13]。與經(jīng)典的限制內(nèi)切酶切割/T4 DNA連接酶法相比，SLIC克隆技術(shù)不僅不受限制性內(nèi)切酶序列的限制，而且可以更高效率的將大目的基因片段連接入大質(zhì)粒片段。我們利用該方法有效的克服了研究初期遇到的目的質(zhì)粒構(gòu)建困難等問題。

在本研究中，我們通過PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建了可誘導(dǎo)性表達(dá)多種流感病毒HA蛋白的細(xì)胞系，該細(xì)胞系的建立為以后深入研究流感病毒HA蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)和創(chuàng)造了條件。

[1] 王志亮, 劉華雷, 趙永剛. 禽流感與人類健康 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2006,20(1): 80-82. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.01.023.

[2] Neumann G, Chen H, Gao GF, et al.H5N1 influenza viruses: outbreaks and biological properties[J]. Cell Res,2010(1), 20: 51-61. doi: 10.1038/cr.2009.124. Epub 2009 Nov 3.

[3] To KK, Chan JF, Chen H, et al. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities[J]. Lancet Infect Dis, 2013(9),13:809-821. doi: 10.1016/S1473-3099(13)70167-1.

[4] Jernigan DB, Cox NJ. H7N9: preparing for the unexpected in influenza[J]. Annu Rev Med,2015,66:361-371. doi: 10.1146/annurev-med-010714-112311.

[5] 董方圓, 王昕, 丁小滿, 等. α-2，6唾液酸受體結(jié)合特異性的H7N9流感病毒的篩選 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2016,30(2): 123-128. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.004.

[6] 王戰(zhàn)會, 齊義鵬, 林裕龍, 等. 乙型肝炎病毒表面抗原突變體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立和抗原性鑒定 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2004,18( 1 ): 47-50. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2004.01.012.

[7] 曹守春, 李玉華, 李加, 等. 穩(wěn)定表達(dá)狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白細(xì)胞系的建立 [J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志,2013,27(6): 483-485. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2013.06.029.

[8] 錢秋杰，車家倩，葉露鵬，等.piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的功能改進(jìn)及在哺乳動物中的應(yīng)用[J]. 遺傳, 2014, 36(10):965-973.

[9] Kim A, Pyykko I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool[J]. Mol Cell Biochem, 2011,354(1-2):301-309.doi: 10.1007/s11010-011-0832-3.

[10] Yusa K, Zhou L, Li MA, et al. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108(4):1531-1536. doi: 10.1073/pnas.1008322108.

[11] Burnight ER, Staber JM, Korsakov P, et al. A hyperactive transposase promotes persistent gene transfer of a piggyBac DNA Transposon[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2012,1:e50.doi: 10.1038/mtna.2012.12.

[12] Wu SC, Meir YJ, Coates CJ, et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(41):15008-15013.doi:10.1073/pnas.0606979103.

[13] Li MZ, Elledge SJ. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC[J]. Nat Methods,2007, 4(3): 251-256.doi: 10.1038/nmeth1010.

(本文編輯：陳培莉)

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Rapid construction of stable cell lines which inducible express HA proteins from various influenza virus strains

ZhangYanjing，HanLianlian，GuoLi，ZhongHui,WangJianwei

PekingUnionMedicalCollege&InstituteofPathogenBiologyChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100730，China

ZhongHui,Email:zhonghui_bj@126.com

Objective An innovative technique was established to rapidly construct various cell lines that could be induced to express multiple influenza A virus (IAV) proteins. Method The HA protein genes of multiple IAVs were cloned into the Cumate-induced expression system which was positioned between two PiggyBac transposon sites. These HA plasmids were transfected into the HEK293A cell line with the PiggyBac transposase plasmids. The transfected cells were screened with puromycin, and after that the corresponding virus proteins were induced with Cumate. Results The results of flow cytometry and Western blotting showed that the virus proteins were expressed in most of the cells in corresponding lines after the induction of Cumate. Conclusion Cell lines which were inducible to express IVA HA protein can be efficiently constructed by using the PiggyBac transposon system.

Influenza virus; PiggyBac transposon; Inducible expression; Cell line construction

鐘輝，Email:zhonghui_bj@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.016

協(xié)和青年基金(3332016140)

流感病毒；PiggyBac轉(zhuǎn)座子；誘導(dǎo)性表達(dá); 細(xì)胞系構(gòu)建

2017-02-01)