邢驍躍 蕪為 張碩 張全福 李川 梁米芳 李建東 李德新

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

·技術(shù)方法·

檢測(cè)基孔肯雅病毒抗原方法的建立與初步評(píng)價(jià)

邢驍躍 蕪為 張碩 張全福 李川 梁米芳 李建東 李德新

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

目的 建立基孔肯雅病毒抗原檢測(cè)方法。方法 利用重組桿狀病毒表達(dá)的基孔肯雅病毒全部結(jié)構(gòu)蛋白組成的病毒樣顆粒免疫小鼠和兔,制備了基孔肯雅病毒特異性多克隆抗體，建立了檢測(cè)基孔肯雅病毒抗原雙抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化了抗體使用濃度和ELISA反應(yīng)條件，以滅活基孔肯雅病毒為陽性參考品評(píng)價(jià)了該方法的檢測(cè)限和重復(fù)性。結(jié)果 利用10份模擬陽性血清、90份陰性血清、40份其他病毒感染者急性期血清初步評(píng)價(jià)該方法的特異性、靈敏性。結(jié)果顯示特異性為100%，檢出限約為10TCID50，板間變異系數(shù)小于10%，板內(nèi)變異系數(shù)小于5%。結(jié)論 雙抗體夾心ELISA方法可以用于檢測(cè)急性期血清樣本中基孔肯雅病毒抗原，為基孔肯雅熱的病原學(xué)診斷提供了新的手段。

Fund programs: National Key Research and Development Program of China (2016YFD0500303)

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是一種主要經(jīng)伊蚊傳播的單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬。人感染后，引起以發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等為主要特征的自限性傳染性疾病。該病的病死率低，但部分患者可產(chǎn)生經(jīng)久不愈的關(guān)節(jié)痛等后遺癥，影響正常的工作生活。傳染源主要為病人、隱性感染者，主要傳播媒介為伊蚊，病毒主要以人-蚊-人的方式循環(huán)。攜帶病毒的患者輸入到有媒介生物分布的地區(qū)，可導(dǎo)致該病的暴發(fā)[1, 2]。1952年在坦桑尼亞發(fā)生暴發(fā)流行中首次分離到CHIKV，1958年在亞洲地區(qū)分離到CHIKV。隨后，在非洲、亞洲引發(fā)了多次暴發(fā)流行，流行特征以不定期出現(xiàn)的暴發(fā)為主。多個(gè)國(guó)家因輸入病例而引發(fā)CHIKV本土傳播，造成暴發(fā)疫情[3, 4]。在我國(guó)，2008年首次發(fā)現(xiàn)輸入性CHIK病例[5]， 2010年在廣東東莞發(fā)生了輸入病例引發(fā)的本地暴發(fā)疫情，報(bào)告200多病例，在云南、海南等地曾發(fā)現(xiàn)疑似CHIKV感染病例[6, 7]。

病例的早診斷、早發(fā)現(xiàn)，對(duì)于暴發(fā)疫情的有效防控極為重要。基孔肯雅熱臨床表現(xiàn)無特異性，確診依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。檢出病毒核酸、抗原，分離到病毒或恢復(fù)期血樣本特異性抗體較急性期有4倍及以上升高可確診。目前，我國(guó)基孔肯雅熱的診斷主要采用核酸、抗體檢測(cè)和病毒分離方法，缺少檢測(cè)CHIKV抗原的方法與試劑。本研究初步建立和評(píng)價(jià)了基于CHIKV病毒樣顆粒免疫制備的多克隆抗體的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)抗原的方法。

1 材料與方法

1.1 CHIKV、重組桿狀病毒、細(xì)胞以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 滅活CHIKV、包含編碼CHIKV結(jié)構(gòu)蛋白C-E3-E2-6K-E1基因的重組桿狀病毒[8]、Vero細(xì)胞、Sf9細(xì)胞由病毒病所出血熱科室保存；昆明鼠購(gòu)自北京維通利華公司,新西蘭兔購(gòu)自京天成生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒樣顆?？乖磉_(dá)純化 按本科室之前制備CHIKV樣顆粒相同方法[8]。在錐形瓶中用無血清的SF900-Ⅱ培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，至細(xì)胞濃度至2×107/ml以上時(shí)，加入一半新的培養(yǎng)基加入重組桿狀病毒，MOI為1左右。感染4 d后每半天觀察一次，至病變細(xì)胞到達(dá)40%～50%時(shí)收獲上清。8 000 rpm(R10A3 日立)離心30 min收取上清，將1 L離心后上清用Viva flow 200超濾器(賽多利斯)濃縮至100 ml左右，然后用40%蔗糖墊層35 000g超速離心4 h，收取墊層上的液體，用20%的蔗糖墊層30 000g超速離心3.5 h，沉淀病毒樣顆粒，用1 ml PBS重懸沉淀。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并用科室保存的CHIKV抗體和相應(yīng)的二抗進(jìn)行Western blot分析。

1.3 多克隆抗體制備

1.3.1 鼠免疫腹水制備：上述濃縮純化的抗原加入完全弗氏佐劑用皮下多點(diǎn)注射接種6周齡昆明鼠，抗原使用量100 μg/只。兩周后進(jìn)行第二次注射，換用不完全弗氏佐劑，其他不變。兩周后采尾血測(cè)抗體滴度，抗體滴度低于1∶10萬(間接ELISA法)進(jìn)行下一次免疫。當(dāng)抗體滴度達(dá)到1∶10萬以上時(shí)，結(jié)束免疫。用活化后的S180細(xì)胞腹腔注射，1～2周后收取腹水，8 000g離心10 min，收取上清。

1.3.2 兔血清制備：選取2.0±0.5 kg雄性新西蘭兔兩只,免疫前耳緣靜脈取血1 ml備用。兔背部刮毛，用上述抗原加入完全弗氏佐劑混合進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。一周后進(jìn)行第二次注射，換用不完全弗氏佐劑，其他不變。第二次注射開始，每次注射前耳緣靜脈取血進(jìn)行滴度檢測(cè)?？贵w滴度低于1∶10萬(間接ELISA法)一周后進(jìn)行下一次免疫。滴度達(dá)到1∶10萬以上，頸動(dòng)脈放血，收取全血，置37℃30 min，然后4℃過夜，3 000 rpm(Multifuge 1L-R,Heraeus)離心5 min收取兔血清。

1.3.3 抗體純化：鼠腹水和兔血清分別使用Hitrap protein G HP 抗體純化柱和Hitrap protein A HP 抗體純化柱，參考說明書操作。

1.4 抗體檢測(cè)

1.4.1 間接免疫熒光：取CHIKV感染Vero細(xì)胞制備的抗原片(由本科室保存),鼠免疫腹水或兔免疫血清用PBS進(jìn)行10倍系列稀釋后加到抗原片的細(xì)胞孔，放入濕盒，37℃孵育30 min，PBS洗6次。以羊抗鼠和羊抗兔IgG-FITC(1∶100 伊文思藍(lán)稀釋)為二抗，放入濕盒，37℃孵育30 min，PBS洗6次。熒光顯微鏡下觀察。

1.4.2 間接法ELISA：用滅活的CHIKV(由本科室保存)，在PH為9.6的碳酸鹽緩沖液中，4℃過夜包被酶標(biāo)板，500 ng/孔。5%脫脂奶300 μl/孔，37℃孵育1 h封閉。將鼠腹水或兔血清從1∶1 000起做2倍系列稀釋后加入，100 μl/孔 37℃孵育1 h，PBST洗6次。將羊抗鼠或羊抗兔IgG-HRP(1∶1 000)加入對(duì)應(yīng)的孔中，100 μl/孔37℃孵育1 h，PBST洗6次。加入底物夜A/B各50 μl/孔，室溫放置15 min，加入終止液用酶標(biāo)儀讀板。

1.5 CHIKV參考品 取已知病毒滴度的CHIKV感染Vero細(xì)胞上清，滅活后進(jìn)行10倍系列稀釋，將每個(gè)濃度的滅活病毒上清分裝保存于-80℃冰箱。每個(gè)稀釋度的滅活病毒取140 μl，用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按照說明書步驟提取RNA。使用ABI公司的AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR 試劑和本科室已發(fā)表的CHIKV實(shí)時(shí)定量RT-PCR定量分析檢測(cè)方法進(jìn)行定量分析[9]，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性空白對(duì)照。使每個(gè)稀釋度的病毒有和滴度對(duì)應(yīng)的Ct值。

1.6 雙抗體夾心ELISA方法 通過棋盤滴定，比較分析分別用兔或鼠多克隆抗體作為捕獲抗體或檢測(cè)抗體的ELISA檢測(cè)體系。使用濃度為100～800 ng/每孔。然后利用抗原參考品對(duì)ELISA反應(yīng)孵育時(shí)間(30 min和60 min)、顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化比較，確定最佳反應(yīng)條件。Cut-off值為陰性對(duì)照孔OD均值的2.1倍(陰性對(duì)照孔OD值低于0.05者按0.05計(jì)算)。

1.7 檢測(cè)限與特異性分析 利用步驟5中所建立的滅活病毒參考品，評(píng)價(jià)雙抗體夾心ELISA檢測(cè)抗原的檢測(cè)限。確定檢測(cè)限后，對(duì)檢測(cè)限稀釋度進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，重復(fù)三次每次三個(gè)復(fù)孔，得到對(duì)應(yīng)Ct值，并與原液稀釋相應(yīng)倍數(shù)后得到的滴度對(duì)比確認(rèn)。選擇本科室保存的北京地區(qū)健康人血清90份、確診登革熱患者急性期血清20份和確診腎綜合征出血熱患者血清20份，用雙抗體夾心法ELISA檢測(cè)CHIKV抗原，計(jì)算特異度。在90 μl正常人血清中加入10 μl滅活病毒原液制成模擬患者血清，初步檢測(cè)敏感性。

1.8 重復(fù)性評(píng)價(jià) 取抗原陽性參考品，制備高濃度(原液)、低濃度(原液進(jìn)行10倍稀釋)樣品，進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)板內(nèi)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算板內(nèi)和板間樣本檢測(cè)吸光度的變異系數(shù)CV，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值×100。

2 結(jié)果

2.1 病毒抗原制備與鑒定 將濃縮純化的病毒樣顆粒，進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析，在55KD、40KD、15KD和10KD左右可以見到蛋白條帶，并且在Western blot中可以見到相應(yīng)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量與基孔肯雅結(jié)構(gòu)蛋白相當(dāng)，基孔肯雅C蛋白約為16×103，E1蛋白約為54×103，E2約為43×103，E3約10×103，6K約6×103。

2.2 多克隆抗體制備 用滅活病毒為包被抗原的間接法ELISA檢測(cè)抗體滴度。單只鼠(共五只分別測(cè)量)腹水和單只兔(共兩只分別測(cè)量)血清效價(jià)分別為1∶128 000、1∶512 000。對(duì)鼠腹水、兔血清分別進(jìn)行IFA檢測(cè)，抗體與抗原反應(yīng)良好，無明顯非特異反應(yīng)(圖1)，滴度為1∶10 000。

A/C：通過間接免疫熒光檢測(cè)兔血清/鼠腹水當(dāng)中的抗CHIKV的IgG抗體;B/D：通過間接免疫熒光檢測(cè)陰性兔血清/鼠腹水當(dāng)中的抗CHIKV的IgG抗體圖1 間接免疫熒光分析制備的CHIKV多克隆抗體A/C：Detection of anti-CHIVK IgG in rabbit antiserum/mice immuno ascitic fluid by IFA(×40);B/D： Detection of anti-CHIVK IgG in normol rabbit serum/mice ascitic fluid (×40)Fig.1 Detection of IgG antibody against CHIKV by IFA

2.3 參考病毒 計(jì)算每個(gè)稀釋度三個(gè)復(fù)孔的Ct值的均數(shù)，經(jīng)過十倍稀釋后TCID50/ml為105、104、103、102、101、100分別對(duì)應(yīng)的Ct值為11.5、16.8、20.2、24.3、28.0、32.3。

2.4 雙抗體夾心ELISA 通過比較兔和鼠抗體用于包被時(shí)的非特異反應(yīng)，確定用鼠免疫腹水作為包被抗體，用PH 9.6的碳酸鹽緩沖液適當(dāng)稀釋，4℃過夜包被酶標(biāo)板。用棋盤滴定選擇合適濃度。通過對(duì)P/N以及非特異反應(yīng)的綜合評(píng)價(jià)，選取500 ng/孔鼠抗體進(jìn)行包被。0.5% BSA 300 μl/孔，37℃孵育2 h進(jìn)行封閉；將陽性參考病毒進(jìn)行2倍系列稀釋后使用。在進(jìn)行孵育時(shí)間對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，孵育1 h的檢出限要優(yōu)于孵育30 min。在實(shí)驗(yàn)中采用37℃孵育1 h，然后PBST洗6次；通過棋盤滴定確定兔血清與二抗的使用濃度，在兔血清1∶1 000二抗?jié)舛?∶8 000時(shí)其P/N值最高，同時(shí)非特異也較小；加入上述兔血清，37℃孵育1 h，PBST清洗6次；加入羊抗兔IgG-HRP，37℃孵育1 h，PBST清洗6次；加入底物液A/B各50/孔，室溫放置5 min，后終止。見圖2。

A 棋盤滴定包被的純化鼠抗體以及二抗?jié)舛? B 棋盤滴定兔血清使用濃度以及二抗?jié)舛? C 孵育時(shí)間的對(duì)比圖2 包被的純化鼠抗體、二抗、兔血清工作濃度以及孵育時(shí)間的優(yōu)化A.Determination of the optimal concentration of mice antibody and second antibody using a chessboard titration measure;B.Determination of the optimal concentration of rabbit serum and second antibody using a chessboard titration measure;C.Comparison of the incubation timeFig.2 Optimization of the concentration of mice antibody, second antibody, rabbit serum and the incubation time

2.5 特異性、檢出限和重復(fù)性評(píng)價(jià) 用雙抗體夾心ELISA對(duì)確診的登革熱、腎綜合征出血熱患者血清各20份及健康人血清90份進(jìn)行CHIKV抗原檢測(cè)，均為陰性，特異性為100%。10份模擬患者血清均為陽性。方法的檢出限在參考病毒稀釋至1∶128～1∶256之間，陽性參考病毒的滴度為105TCID50/ml，經(jīng)過約200倍稀釋，滴度在5×102TCID50/ml以下，即在0.1 ml樣本中CHIKV滴度在50 TCID50以上時(shí)可以被本方法檢測(cè)出。對(duì)檢出限病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)，其Ct值約為20(19.6±0.49)，CV=2.5，對(duì)應(yīng)的滴度為103TCID50/ml[10]。通過高濃度組、低濃度組重復(fù)檢測(cè)，同一樣本在板內(nèi)和板間的重復(fù)檢測(cè)中，OD值呈現(xiàn)較高的重復(fù)性(圖3)。板間變異系數(shù)為5.67±0.7(95%可信區(qū)間：3.5～7.8)，板內(nèi)變異系數(shù)為3.5±0.6(95%可信區(qū)間：2.2～4.8)。

圖3 雙抗體夾心法ELISA重復(fù)性試驗(yàn)Fig.3 Repeatability of the double antibody sandwich ELISA

3 討論

CHIKV主要通過伊蚊傳播，人感染后可引起以關(guān)節(jié)痛和發(fā)熱為主要癥狀的基孔肯雅熱，病程持續(xù)數(shù)周到數(shù)月不等。2016年同樣以伊蚊為媒介的寨卡病毒開始大范圍傳播，WHO將其升級(jí)為全球緊急公共衛(wèi)生事件[11]，年初我國(guó)發(fā)生寨卡輸入性病例[12]。我國(guó)東南沿海地區(qū)是伊蚊主要自然棲息地[13-15]，常有登革熱的暴發(fā)；而登革病毒與CHIKV的傳播媒介相同，我國(guó)存在發(fā)生基孔肯雅熱暴發(fā)流行的可能性[16-18]。由于基孔肯雅熱和登革熱、寨卡病毒病的臨床表現(xiàn)相似，臨床不易鑒別，需通過實(shí)驗(yàn)室特異性檢測(cè)加以確診。在既往登革熱暴發(fā)地區(qū)是否已存在基孔肯雅熱的共同流行，是應(yīng)當(dāng)高度重視的問題。有必要建立便捷、敏感和特異的基孔肯雅熱診斷方法，提高蚊媒傳染病的防控能力。

本研究采用無感染性的病毒樣顆粒免疫動(dòng)物，使動(dòng)物免疫的生物安全得到保證。使用的重組桿狀病毒包含CHIKV的結(jié)構(gòu)蛋白C-E3-E2-6K-E1，感染Sf9細(xì)胞，表達(dá)并且包裝成病毒樣顆粒，其抗原性與CHIKV相同。由于CHIKV結(jié)構(gòu)蛋白較多，不易對(duì)抗原進(jìn)行定量，本研究使用病毒滴度作為參考。由于目前基孔肯雅熱的診斷多采用real-time PCR，為能夠和一些有關(guān)報(bào)道比較，同時(shí)用real-time PCR測(cè)定了參考病毒的核酸。本研究建立的檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法ELISA，具有較好的特異性和檢出限，在0.1 ml標(biāo)本中CHIKV滴度在50TCID50以上均可以被本方法檢測(cè)出。Santhosh等[19]在印度南部地區(qū)基孔肯雅熱流行時(shí)，用real-time PCR檢測(cè)了51份疑似患者的急性期血清，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者病毒核酸的Ct值在13—20之間，少數(shù)患者會(huì)低于13。本研究制作的模擬患者血清，將參考品10倍稀釋加入正常人血中，其Ct均值為16.8，和大多數(shù)患者的病毒載量接近。Ummul等[20]在馬來西亞2008年基孔肯雅熱暴發(fā)時(shí)，在疫區(qū)捕獲蚊子，每10只分為一組進(jìn)行CHIKV的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均為陽性，病毒量在3×105-6×106拷貝/μl。根據(jù)本科室之前做的標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]，其對(duì)應(yīng)的Ct值在18—20之間。Hugo等[22]建立了人工感染CHIKV的蚊模型，發(fā)現(xiàn)人工感染的蚊體內(nèi)病毒量約為105TCID50/ml?？梢奀HIKV在急性期患者體內(nèi)以及主要媒介蚊體內(nèi)的病毒載量均在本方法的檢測(cè)限之上。蟲媒病毒病防控的重點(diǎn)之一是媒介攜帶病毒的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，本方法簡(jiǎn)單、成本低適用于媒介生物的監(jiān)測(cè)?？刂萍膊〉谋┌l(fā)，病例的早期診斷非常重要，ELISA方法檢測(cè)耗時(shí)短，適合在基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)使用。對(duì)于臨床癥狀相似的傳染病，病原體的分離檢測(cè)是有效的鑒別診斷的手段，CHIKV分離耗時(shí)較長(zhǎng)，抗原檢測(cè)ELISA方法的建立，可以快速的鑒定病原，對(duì)于疫情的早期應(yīng)急反應(yīng)、預(yù)防控制工作有重要意義。本研究仍有以下不足之處，制備的抗體均為多克隆抗體，對(duì)于抗原捕獲的效率相比單克隆抗體要低。免疫用抗原的純化仍有改進(jìn)的空間。希望可以對(duì)該方法進(jìn)一步完善，提高敏感性。

綜上所述，本研究通過表達(dá)CHIKV的VLP樣顆粒，制備多克隆抗體，建立了捕獲抗原的ELISA方法，并進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為基孔肯雅熱的診斷和監(jiān)測(cè)提供了新的方法。

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(本文編輯：唐瀏英)

Development of a double antibody sandwich ELISA for detection of Chikungunya virus antigen

XingXiaoyue,WuWei,ZhangShuo,ZhangQuanfu,LiChuan,LiangMifang,LiJiandong,LiDexin

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

LiDexin,Email:lidx@chinacdc.cn

Objective To establish a method for detection of chikungunya virus(CHIKV) antigen. Methods CHIKV virus like particle(VLP),that contains all structural proteins, was prepared by baculovirus expression system. Mice and rabbits were immunized with the VLP to develop antibodies against CHIKV. A double antibody sandwich ELISA was established for detection of CHIKV antigens. The concentrations of the antibodies used and the reaction conditions were optimized. The detection limit and repeatability of the ELISA was evaluated. Results The sensitivity and specificity was estimated by 10 mimicking CHIKV sera, 90 health person sera,40 other virus infected sera. It was show that the specificity of DAS-ELISA was 100%, the detection limit was 10 TCID50,the coefficients of variation (CV) within plate was <5%,theCVof different plates was <10%.Conclusions The double antibody sandwich ELISA established in this study can be used to detect the CHIKV antigen in acute phase serum of patient and provide a method for detection of CHIKV.

Chikungunya virus; Virus like particle; Double antibody sandwich ELISA

李德新，Email：lidx@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.02.014

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0500303)

基孔肯雅病毒；病毒樣顆粒；雙抗體夾心ELISA

2017-01-05)