陸 磊，馮 超，崔學(xué)兵，楊繼武，秦 燕，劉仁貴*

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院外六科，云南大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

葡萄籽原花青素對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的效應(yīng)研究

陸 磊1，馮 超1，崔學(xué)兵1，楊繼武1，秦 燕2，劉仁貴1*

（1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院外六科，云南大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：探討葡萄籽原花青素（GSPE）對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（LEASO）的防治作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法:新西蘭雄性家兔30只，進(jìn)行LEASO模型復(fù)制。隨機(jī)分為正常對(duì)照組（CON組）、模型組（LEASO組）和GSPE干預(yù)組（GSPE組）（0.5 g/kg），每組10只。于術(shù)后第4、8、12周檢測(cè)家兔血清TC（總膽固醇）及ox-LDL（氧化低密度脂蛋白）水平，第12周末檢測(cè)SOD、MDA含量。分別在術(shù)前及術(shù)后12周對(duì)各組家兔行右后肢Doppler檢查；第12周末行家兔雙后肢DSA。結(jié)果：與CON組比較，LEASO組家兔有跛行，見右后肢足趾甚至右足壞疽，GSPE組的肢體活動(dòng)基本正常，未見壞疽；與LEASO組比較，GSPE組血清ox-LDL水平在第8、12周均明顯降低（P＜0.05）；第12周末，血清SOD活性升高的同時(shí)MDA下降（P＜0.05）。Doppler顯示GSPE組家兔股淺動(dòng)脈遠(yuǎn)端PV值較LEASO組明顯升高（P＜0.01）；DSA顯示GSPE組家兔右后肢股淺動(dòng)脈僅呈節(jié)段性閉塞，遠(yuǎn)端血管顯影良好，有側(cè)支循環(huán)建立。結(jié)論：GSPE對(duì)LEASO具有一定的防治作用，其機(jī)制可能是通過清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化水平等途徑實(shí)現(xiàn)的。

GSPE；下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥；抗氧化；防治作用

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（lower extremity arterio?sclerosis obliterans，LEASO）是一種常見的慢性肢體缺血性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化是其發(fā)病的基礎(chǔ)。隨著人類社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，人類飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，生活質(zhì)量提高，人均壽命延長(zhǎng)，社會(huì)老齡化越來越明顯，LEASO的發(fā)病率也有明顯升高〔1〕。研究表明LEASO是一種以血管壁中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化為特征的高氧化應(yīng)激狀態(tài)〔2〕。據(jù)此，有效清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化水平就有可能減緩甚至阻止動(dòng)脈硬化的發(fā)生。

葡萄籽原花青素（GSPE）是一種多酚化合物，具有多種生物學(xué)活性，尤其是它強(qiáng)大的抗氧化作用。本研究在成功建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上觀察GSPE對(duì)下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的防治效果并探討其機(jī)制，為該疾病的藥物治療尋找新的突破點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1試劑、藥品超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒、考馬斯亮蘭檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GSPE（西安小草植物科技有限責(zé)任公司），其他均為常用化學(xué)試劑。嚴(yán)格按照試劑盒說明由專人進(jìn)行各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備T6紫外分光光度計(jì)（北京普析）；18R高速冷凍離心機(jī)TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀H7180型（日本日立）；Terason T3000便攜式彩色超聲多普勒儀（美國GE）；Allura CV20型數(shù)字減影血管造影X線機(jī)（荷蘭飛利浦）。

1.3分組及處理新西蘭雄性家兔30只，體重1.90～2.10 kg（大理大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為正常對(duì)照組（CON組）、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥模型組（LEASO組）及葡萄籽原花青素干預(yù)組（GSPE組），每組10只。CON組給予常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料，而LEASO組及GSPE組給予高脂飼料喂養(yǎng)。同時(shí)，GSPE組給予5%GSPE混懸液灌胃（0.5 g/（kg·d）），連續(xù)12周，而CON組和LEASO組給予同體積的生理鹽水灌胃。

1.4動(dòng)物模型的制備高脂飼料喂養(yǎng)2周后，對(duì)LEASO組及GSPE組進(jìn)行造模。20%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉家兔后，于腹股溝區(qū)解剖右股動(dòng)脈，結(jié)扎其側(cè)支及股深動(dòng)脈，在快速阻斷股動(dòng)脈血流后在股動(dòng)脈前壁剪開一小口，向遠(yuǎn)端插入2F Fogarty球囊導(dǎo)管直至膝關(guān)節(jié)處，擴(kuò)張球囊之后來回拖動(dòng)導(dǎo)管5次破壞股淺動(dòng)脈內(nèi)膜，7-0血管縫合線縫合股動(dòng)脈切口。術(shù)后給予青霉素G肌注（40 000 U/kg），連續(xù)3 d。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清TC、ox-LDL水平測(cè)定 造模后第4、8、12周于家兔耳緣靜脈采血檢測(cè)血清總膽固醇（TC）及氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.5.2 血清NO、SOD及MDA含量的檢測(cè) 第12周末自家兔下腔靜脈取血4 mL，4 500 r/min，離心10 min，保留血清備用。分別在550、630及532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定血清NO、SOD、MDA的含量。

1.5.3 血管彩色超聲多普勒探測(cè) 造模前及造模12周后分別對(duì)3組家兔行后肢血管彩色超聲多普勒檢查，檢測(cè)后肢股動(dòng)脈血流情況，采集各組家兔后肢股動(dòng)脈血流頻譜圖及峰值流速（peak systolic velocity，PV）。

1.5.4 肢體血管造影 造模12周末，行后肢動(dòng)脈造影。觀察雙側(cè)股動(dòng)脈血流情況，采集各組家兔后肢動(dòng)脈造影圖。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用方差分析進(jìn)行三組間差異性比較，若差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用SNK法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1各組家兔血清TC水平與CON組比較，LEASO組和GSPE組血清TC水平于第4周明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。之后該兩組的血清TC水平持續(xù)維持于高水平。GSPE組的TC水平在第4、8、12周與LEASO組比較，無明顯差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組家兔血清TC水平的變化（mmol/L，

表1 各組家兔血清TC水平的變化（mmol/L，

注：與CON組比較▲P＜0.05；與LEASO組比較★P>0.05。

組別0周4周8周12周CON組1.38±0.21 1.41±0.17 1.37±0.36 1.52±0.48 LEASO組1.42±0.27 23.98±1.16▲24.27±1.03▲24.52±1.97▲GSPE組1.32±0.35 24.11±1.24★▲23.91±1.67★▲24.27±1.16★▲

2.2各組家兔血清ox-LDL水平與CON組比較，LEASO組血清ox-LDL水平于第4周開始升高，第8及第12周呈明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GSPE組血清ox-LDL水平于第8及12周明顯低于LEASO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組家兔血清ox-LDL水平的變化（mmol/L

表2 各組家兔血清ox-LDL水平的變化（mmol/L

注：與CON組比較★P＜0.05，與LEASO組比較▲P＜0.05。

組別0周4周8周12周CON組20.47±1.23 21.84±3.01 24.06±4.58 22.48±3.23 LEASO組21.03±1.82 26.21±2.41★50.31±6.21★56.27±4.36★GSPE組20.87±2.33 25.11±1.32★41.23±5.86★▲44.39±5.61★▲

2.3各組家兔血清NO、SOD、MDA含量與CON組比較，LEASO組、GSPE組造模12周后血清SOD活性及NO水平明顯降低，而MDA的含量升高（P＜0.05）；與LEASO組比較，GSPE組血清SOD活性及NO水平明顯上升，同時(shí)MDA的含量下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的變化（

表3 各組家兔12周末血清MDA、SOD、NO含量的變化（

注：與CON組比較★P＜0.05；與LEASO組比較▲P＜0.05。

組別MDA/（nmol/mL）SOD/（U/mL）NO/（nmol/mL）CON組LEASO組2.89±0.13 8.31±0.26★125.65±2.18 53.41±3.85★82.14±10.71 25.24±3.43★GSPE組7.68±0.42★▲89.88±2.11★▲37.28±2.62★▲

2.4各組家兔肢體血管彩色超聲多普勒探測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)前各組家兔后肢股動(dòng)脈遠(yuǎn)端峰值流速（PV）值無明顯差異。造模12周后測(cè)定各組右后肢股動(dòng)脈遠(yuǎn)端PV值，GSPE組及LEASO組的股動(dòng)脈遠(yuǎn)端PV值較CON組明顯降低，差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與LEASO組比較，GSPE組家兔股動(dòng)脈遠(yuǎn)端PV值是其2倍以上，呈明顯的升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組家兔右后肢股動(dòng)脈遠(yuǎn)端峰值流速PV值（cm/s）

2.5各組家兔肢體血管造影各組家兔DSA結(jié)果顯示：CON組雙側(cè)股淺、股深動(dòng)脈正常顯影；LEASO組右股深、淺動(dòng)脈完全性閉塞，遠(yuǎn)端無明顯血流，無明顯側(cè)支循環(huán)形成；GSPE組顯示股深動(dòng)脈未見顯影，手術(shù)部位以下的右股淺動(dòng)脈節(jié)段性閉塞，但遠(yuǎn)端動(dòng)脈顯影良好，并可見豐富的側(cè)支循環(huán)形成。見圖1。

圖1 各組家兔肢體血管造影圖

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一可累及全身血管的彌漫性病變，LEASO是在全身性動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上的肢體表現(xiàn)，越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展以多種不同的方式進(jìn)行，無論從結(jié)構(gòu)還是生物學(xué)觀點(diǎn)，都表現(xiàn)為一種動(dòng)力學(xué)進(jìn)程。國外報(bào)道40歲以后，每10年該病的發(fā)病率可增高2～3倍，55歲以上人群約有20%有不同程度的動(dòng)脈硬化閉塞并可引發(fā)臨床癥狀〔1〕。目前，動(dòng)脈硬化閉塞癥的病因不十分清楚，血管細(xì)胞、血細(xì)胞和脂蛋白之間的相互作用十分重要并摻雜其中。新近的研究顯示LEASO表現(xiàn)為一種高氧化應(yīng)激狀態(tài)，以血管壁中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化為特征〔2〕，在此病理過程中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激扮演了重要角色〔3〕，ROS不僅氧化修飾低密度脂蛋白，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，而且其介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，致其功能障礙，從而促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展〔4-5〕。據(jù)此，筆者認(rèn)為減少ROS的生成，減輕脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，就能減輕或抑制LEASO的發(fā)展。

GSPE極強(qiáng)的抗氧化及清除自由基的活性已得以證實(shí)，其在體內(nèi)的抗氧化活性是維生素C的20倍，維生素E的50倍〔6〕。除其直接抗氧化作用外，它還可通過降低內(nèi)外源性的氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)而起到抗氧化損傷作用。此外，GSPE亦可捕獲水溶性物質(zhì)（例如血清、動(dòng)脈壁間質(zhì)液等）中的ROS，清除自由基，抑制LDL（低密度脂蛋白）的氧化，發(fā)揮抗動(dòng)脈硬化的作用〔7-8〕。如果GSPE通過清除氧自由基的生成，減輕脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，也就有可能減輕或抑制LEASO的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)通過飼喂家兔高膽固醇飼料及行球囊導(dǎo)管損傷血管內(nèi)膜，成功建立LEASO的動(dòng)物模型，同時(shí)給予GSPE進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：造模第4周LEASO組及GSPE組血清TC水平均已明顯升高，之后一直維持在較高水平，與CON組比較均有顯著性差異（P＜0.05），表明高脂血癥的模型復(fù)制成功。但是GSPE組與LEASO組比較，兩組間則沒有差異，表明GSPE對(duì)血清血脂水平幾乎沒有影響，這一結(jié)果與部分文獻(xiàn)的報(bào)道相一致。然而，我們卻觀察到，GSPE組從第8周開始，血清ox-LDL水平有明顯下降，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，血清ox-LDL水平一直低于LEASO組，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ox-LDL由血漿中的LDL經(jīng)過氧化修飾形成，是粥樣斑塊的特征性成分之一。ox-LDL能促使巨噬細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)而成為泡沫細(xì)胞，而粥樣斑塊的主要成分正是泡沫細(xì)胞累積而成的脂質(zhì)核心，并且ox-LDL具有高度的細(xì)胞毒性，可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展，是LEASO形成過程中的重要中介因素〔9-10〕。因此，GSPE抑制了血清LDL的氧化修飾，就能減緩或阻抑動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)生與發(fā)展，從而有利于改善LEASO組家兔肢體的缺血癥狀。

家兔血清SOD活性，NO含量及MDA含量的測(cè)定顯示：GSPE組SOD活性、NO水平明顯升高，高于LEASO組，與此同時(shí)MDA含量明顯降低，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SOD能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損害，SOD活性的高低間接反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力；MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞功能障礙，甚至死亡，其含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSPE有較強(qiáng)的清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的能力。正是由于GSPE的抗氧化作用，致使血清ox-LDL水平明顯低于LEASO組。影像學(xué)的資料也顯示：第12周，GSPE組家兔右后肢股動(dòng)脈遠(yuǎn)端峰值流速（PV）值較LEASO組明顯升高，是其2倍以上，說明GSPE干預(yù)后家兔右后肢缺血情況有了明顯改善；DSA則更直觀地顯示了GSPE組股動(dòng)脈出現(xiàn)部分再通，遠(yuǎn)端動(dòng)脈顯影及豐富的側(cè)支循環(huán)建立，較LEASO組有了明顯改善。在實(shí)驗(yàn)過程中也同時(shí)觀察到CON組家兔正常進(jìn)食及活動(dòng)，LEASO組家兔進(jìn)食尚可，但活動(dòng)明顯減少，有跛行現(xiàn)象，右后肢皮溫明顯降低，并可見右后肢足趾壞疽甚至右足壞疽。而GSPE組家兔與CON組家兔一樣正常進(jìn)食及活動(dòng)，無跛行，未見足趾壞疽，這些表現(xiàn)與上述影像學(xué)結(jié)果是相一致的。

綜上所述，GSPE干預(yù)能有效改善LEASO肢體的缺血癥狀，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，從而阻止或減緩LEASO的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)該病表現(xiàn)出良好的防治效果，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究及報(bào)道。其機(jī)制可能與其強(qiáng)大的抗氧化作用（如清除氧自由基、降低脂質(zhì)過氧化水平等）有關(guān)，GSPE能否直接或間接促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，則有待進(jìn)一步的證實(shí)。

〔1〕BEHAR T，BOSSON J L，GALANAUD J P，et al.Preva?lence and risk factors of peripheral arterial disease in an outpatient screening campaign〔J〕.J Mal Vasc，2013，38（1）：22-28.

〔2〕HUANG H，KOELLE P，F(xiàn)ENDLER M，et al.Induction of inducible nitric oxide synthase（iNOS）expression by ox?LDL inhibits macrophage derived foam cell migration〔J〕.Atherosclerosis，2014，235（1）：213-222.

〔3〕GLIEMANN L，NYBERG M，HELLSTEN Y.Nitric oxide and reactive oxygen species in limb vascular function：what is the effect of physical activity〔J〕.Free Radic Res，2014，48（1）：71-83.

〔4〕TAVAKOLI S，ASMIS R.Reactive oxygen species and thiol redox signaling in the macrophage biology of atherosclero?sis〔J〕.Antioxid Redox Signal，2012，17（12）：1785-1795.

〔5〕SUN Y，CHEN X.Ox-LDL-induced LOX-1 expression in vascular smooth muscle cells：role of reactive oxygen spe?cies〔J〕.Fundam Clin Pharmacol，2011，25（5）：572-579.

〔6〕孫靜，李偉，詹純烈.葡萄籽原花青素改善睡眠功能試驗(yàn)研究〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（3）：341-343.

〔7〕ASHA DEVI S，SAGAR CHANDRASEKAR B K，MANJU?LA K R，et al.Grape seed proanthocyanidin lowers brain oxidative stress in adult and middle-aged rats〔J〕.Exp Gerontol，2011，46（11）：958-964.

〔8〕JIA Z，SONG Z，ZHAO Y，et al.Grape seed proanthocyani?din extract protects human lens epithelial cells from oxida?tive stress via reducing NF-кB and MAPK protein expres?sion〔J〕.Mol Vis，2011，17：210-217.

〔9〕FERNáNDEZ-IGLESIAS A，QUESADA H，DíAZ S，et al. Combination of grape seed proanthocyanidin extract and docosahexaenoic acid-rich oil increases the hepatic detoxi?fication by GST mediated GSH conjugation in a lipidic post?prandialstate〔J〕.Food Chem，2014，165：14-20.

〔10〕PONS Z，GUERRERO L，MARGALEF M，et al.Effect of low molecular grape seed proanthocyanidins on blood pressure and lipid homeostasis in cafeteria diet-fed rats〔J〕.J Physiol Biochem，2014，70（2）：629-637.

Protective Effectof Grape Seed Proanthocyanidin Extracton Lower Extremity Arteriosclerosis Obliterans

Lu Lei1,Feng Chao1,Cui Xuebing1,Yang Jiwu1,Qin Yan2,Liu Rengui1*
（1.DepartmentofGeneral Surgery,The First Affiliated Hospitalof Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Grape Seed Proanthocyanidin Extract（GSPE）on lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO）,and to preliminarily explore its action mechanism.Methods:30 male New Zealand rabbits were randomly divided into three groups with 10 animals each to duplicate LEASO model.They were normal control group（CON group）, LEASO model group,and GSPE group（0.5 g/kg）.The TC and ox-LDL in serum were assayed after operation for 4 th,8 th and 12 th week.At the end of 12th week,the contentof SOD and MDA were detected.The right posterior femoral artery blood flow was detected by color doppler ultrasound,and digital subtraction angiography（DSA）of the double posterior limbs in rabbit was conducted before the operation and after 12th week.Results:Compared with CON group,rabbits of LEASO group had claudication and thanatosis was found in both posterior limbs.GSPE group showed normal activity without thanatosis.Compared with LEASO group,GSPE group's serum ox-LDL level decreased significantly at the end of 8th,12th week after operation（P＜0.05）.The activity of serum SOD raised obviously while MDA decreased significantly（P＜0.05）.Compared with LEASO group,GSPE group showed higher PV of right posterior superficial femoral artery under the detection of color doppler ultrasound（P＜0.01）.Detection of digital subtraction angiography（DSA）showed that the distal vascular imaging of right posterior superficial femoral artery was good in GSPE group and visible abundant collateral circulation was established.Conclusion:GSPE had a prominent protective effect on LEASO via removing free radicals,reducing lipid peroxidation level,etc.

GSPE;lower extremity arteriosclerosis obliterans;antioxidation;protective effect

R285.5

A

2096-2266（2017）04-0036-05

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.04.010

（責(zé)任編輯 李 楊）

云南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（0900158）

2016-04-29

2016-12-29

陸磊，碩士研究生，主要從事普外基礎(chǔ)與臨床研究.

*通信作者：劉仁貴，主任醫(yī)師.