史艷財　唐健民　柴勝豐　鄒蓉　陳宗游　韋霄

摘要： 采用ISSR分子標記技術，對廣西特有珍稀瀕危植物小花異裂菊6個野生種群的遺傳多樣性進行了研究。結果表明：10條引物對141個個體共檢測到96個位點，其中29個位點具有多態(tài)性，多態(tài)位點百分率（PPB）為30.21%。在物種水平上，小花異裂菊PPB為30.21%，Neis基因多樣性指數(shù)（H）為0.105 4，Shannons信息指數(shù)（I）為0.154 6。在種群水平上，PPB為9%～19%，H為0.021 2～0.051 3，I為0.033 9～0.080 5?；贜eis遺傳多樣性分析所得出的種群間基因分化系數(shù)Gst=0.690 5，表明種群內(nèi)的遺傳變異為30.95%，種群間的遺傳變異為69.05%，小花異裂菊的遺傳變異主要存在于種群間。AMOVA分析結果與前面結果相符。小花異裂菊種群間的基因流（Nm）為0.224 2。從遺傳距離看，楊堤和興坪種群的遺傳距離最小，為0.039 8，白沙和陽朔之間的遺傳距離最大，為0.160 9。在UPGMA聚類圖中，6個種群可分為兩組，陽朔和高田為一組，普益、白沙、興坪、楊堤聚為一組。研究認為小花異裂菊的自交親和的繁育系統(tǒng)和分布區(qū)域的片段化可能是導致種群遺傳多樣性較低和種群間高遺傳分化的主要原因。該研究結果為該物種種質(zhì)資源的保護提供了科學依據(jù)。

關鍵詞： 小花異裂菊， ISSR， 遺傳多樣性， 遺傳分化

中圖分類號： Q311

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）01000906

Abstract： Heteroplexis microcephala is an endangered plant only found in karst limestone regions in the Yangshuo County of Guangxi Zhuang Autonomous Region in China. In the present study， ISSR markers were used to evaluate the genetic variation within and among wild populations that were sampled from Guangxi with a goal to collect basic genetic information for its conservation. Leaf samples of 141 individuals were collected from six counties. Based on 10 ISSR primers， 96 clear and reproducible DNA fragments were generated. The percentage of polymorphic bands （PPB） was 30.21%， Neis gene diversity （H） was 0.105 4， Shannon information index （I） was 0.154 6 at the species level， and PPB among population ranged from 9% to 19%， H ranged from 0.021 2 to 0.051 3， I ranged from 0.033 9 to 0.080 5. High levels of genetic differentiation among the populations （Gst=0.690 5） were detected on the basis of results from POPGENE， which indicated that 69.05% of the genetic variability was distributed among populations， and only 30.95% of the variation existed within populations. Molecular variance was also examined using AMOVA based on RAPD banding patterns. The variance component found within populations was 27.28%， and a variance of 72.72% was found among populations. Gene flow（Nm） among the population was 0.224 2 indicating that there was a low migration rate between populations. The highest genetic distance based on Neis genetic genetic distance for all population pairs was 0.160 9 between populations BS and YS， while the lowest was 0.039 8 between XP and YD. UPGMA analysis was performed based on genetic similarity （Jaccard coefficient）. Six populations were clustered into two main groups， one containing populations YS and GT， and the other containing PY， BS， XP and YD. The high genetic variance among populations and the low genetic diversity within population could be attributed to the breeding system of part selfcompatibility and the limited gene flow among populations of H. microcephala.

Key words： Heteroplexis microcephala， ISSR， genetic diversity， genetic relationship

異裂菊屬（Heteroplex Chang）為廣西稀有的特有屬，1937年作為一個單種屬發(fā)表（陳藝林，1985）。該屬5個種全部為中國特有種：異裂菊（H. svernonioides）、小花異裂菊（H. microcephala）、絹葉異裂菊（H. sericophylla）、凹脈異裂菊（H. impressinervia）和柳州異裂菊（H. incana）（陳藝林，1985；梁健英，1994；覃海寧和劉演，2010）。小花異裂菊地理分布范圍十分狹小，僅分布于廣西陽朔縣石灰?guī)r石山山頂?shù)莫M小區(qū)域，種群個體數(shù)量很少。近年來，由于自然生態(tài)環(huán)境和植被遭受破壞，該種的野生植株正在逐年減少。小花異裂菊對于研究菊科某些類群的分類及其演化具有重要的科學價值，已被列為國家二級保護植物（付立國，1992）。

小花異裂菊一般不能形成大的群落，只分布在石山上部的小片區(qū)域，形成局部片段群落，這種片段化分布極有可能會對小花異裂菊的遺傳多樣性及其進化潛能造成影響。近年來，小花異裂菊的研究只有核型（張國莉和龔洵，2002）、化學成分（樊曉娜等，2010）、異地保護適應性（黃仕訓等，2002）、ISSR分析條件優(yōu)化（史艷財?shù)龋?012）等少數(shù)幾個方面，對于其分子水平的研究尚未見報道。通過物種的遺傳多樣性及其遺傳結構的分析可以加深對該植物進化歷史和適應機制的認識，并可為該植物的保護提供科學的指導。對于不同群落類型小花異裂菊種群的遺傳多樣性變化規(guī)律的研究將可深入了解其適應進化及其瀕危機制。ISSR集SSR和RAPD技術的優(yōu)點于一身，實驗操作快速、簡單，費用低，可檢測到的遺傳多態(tài)性高，是Zietkiewicz & Rafalskia （1994）提出的一種分子標記技術。目前，ISSR已廣泛應用于植物系統(tǒng)演化、分類以及遺傳多樣性等研究（莫文娟等，2013）。本文采用ISSR技術從DNA水平分析了小花異裂菊種群的遺傳多樣性和遺傳結構，以闡明小花異裂菊對環(huán)境的適應機制及其進化潛力，為有效保護小花異裂菊的遺傳資源提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1 供試材料

2012年在廣西桂林市陽朔縣選擇6個小花異裂菊種群采集樣品，每個種群采集15～40個生長健壯、無病蟲害植株的幼嫩葉片，植株之間至少間隔5 m。選取每個植株嫩葉3～5片，裝于放有硅膠的封口袋中干燥保存（柴勝豐等，2014）。6個種群的地理位置分布見表1。

1.2 基因組DNA提取與聚合酶鏈式反應（PCR）擴增

植物總DNA采用改良后的CTAB法提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計分別檢驗DNA質(zhì)量和濃度，置于-20 ℃冰箱中保存。ISSRPCR反應體系為25 μL的體系中含dNTP 0.20 mmol·L1，Mg2+ 1.5 mmol·L1， TaqDNA聚合酶1.5 U，模板DNA 50 ng， 引物0.8 μmol·L1， 10×Buffer 2.5 μL。最后確定的PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；40個循環(huán)；94 ℃變性40 s；53 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳1～2 h，然后用0.5 μg·mL1 的EB液染色20 min， 置于UVP凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.3 引物篩選

擴增引物采用加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的第9套100條ISSR引物序列，序列在上海生物工程公司合成。從6個種群中各選取1個個體進行引物擴增篩選。用10條擴增條帶清楚、重復性好的引物（表2）用于所有個體的擴增。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

按照電泳圖譜中同一位置上DNA條帶有或無賦值，無帶（隱性）記為“0”有帶（顯性）記為“1”。多態(tài)位點百分率（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測等位基因數(shù)（Na）、Shannons信息指數(shù)（I）、Neis基因多樣性（H）群體總基因多樣性（Ht）、各群體之間的遺傳分化指數(shù)（Gst）和Neis遺傳距離利用POPGENE 3.2軟件和NTSYSpc2.1軟件計算（張杰等，2012）。

采用DCFA1.1軟件計算歐式距離平方和，用WINAMOVA1.55軟件進行分子方差分析，計算種群內(nèi)、種群間的變異方差分布。小花異裂菊種群間的遺傳關系聚類分析基于Neis遺傳距離，利用NTSYS pc2.1軟件的非加權配對算數(shù)平均法（UPGMA）計算（卜靜等，2012）。

2結果與分析

2.1 小花異裂菊的遺傳多樣性

10條引物對小花異裂菊6個種群141個個體共擴增出96條條帶，其中29條多態(tài)帶，多態(tài)位點比率為（PPB）30.91%。10條引物擴增總帶數(shù)1～10不等，平均擴增帶數(shù)為2.9。在物種水平上，小花異裂菊PPB為30.21%，Neis基因多樣性（H）為0.105 4，Shannons信息指數(shù)（I）為0.154 6；在種群上平上，PPB的變化范圍為9～19%，平均為13.33%，H的變化范圍為0.021 2～0.051 3，平均為0.032 5；I變化范圍為0.033 9～0.080 5，平均為0.052 2。觀測等位基因數(shù)為1.090 0～1.190 0，有效等位基因數(shù)為1.034 1～1.082 3。種群YS的多態(tài)位點百分率、等位基因數(shù)、觀測等位基因數(shù)、有效Neis基因多樣性以及Shannons信息指數(shù)均高于其他種群，BS種群最低。

2.2 小花異裂菊種群的遺傳結構

小花異裂菊總的基因多樣性（Ht）為0.105 0，種群內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.032 5，種群間的基因多樣性（Dst）為0.072 5，基因分化系數(shù)（Gst）為0.690 5，總的遺傳變異中有69.05%來自于種群間，種群內(nèi)的遺傳變異占30.95%，說明小花異裂菊的遺傳變異主要來自于種群間。AMOVA分析結果與前面結果相符，在總的遺傳變異中，27.28%的變異發(fā)生在種群內(nèi)，72.72%的變異發(fā)生在種群間，說明遺傳變異主要發(fā)生在種群間。小花種群間的基因流（Nm）為0.224 2。

2.3 小花異裂菊種群間的遺傳一致度和遺傳距離

從遺傳距離看，YD和XP的遺傳距離最小，為0.039 8，BS和YS之間的遺傳距離最大，為0.160 9。從遺傳一致度看，YD和XP的遺傳一致度最高，為0.961 0，BS和YS的遺傳一致度最低，為0.851 4，兩者表現(xiàn)規(guī)律基本一致。在UPGMA聚類圖中，6個種群可分為兩組，YS和GT為一組，PY、BS、XP、YD聚為一組。

3討論

3.1 小花異裂菊的遺傳多樣性

許多研究結果證明稀有、特有或分布區(qū)很狹窄的物種其遺傳多樣性水平都相應偏低（李昂和葛頌，2002），但也有些卻能保持較高水平的遺傳多樣性（Richter et al，1994）。采用ISSR技術得到的小花異裂菊6個野生種群物種水平的PPB、H、I的值分別為30.21%、0.105 4、0.154 6，小花異裂菊種群內(nèi)的遺傳多樣性PPB=13.33%，Hs=0.032 5，H=0.032 5，I=0.052 2，種群間遺傳分化程度Gst=0.690 5，多樣性指數(shù)均較低，低于種子風媒植物（Hs=0.261，Gst=0.23）、異花傳粉植物（Hs=0.260，Gst=0.23）和長命植物（Hs=0.242，Gst =0.23）的平均水平（Ge et al， 2003）以及Nybom & Bartishji（2000）基于RAPD、AFLP、ISSR等顯性標記所統(tǒng)計的107個物種總結得出的平均遺傳多樣性（PPB=71.02%），表明其種群水平和物種水平上遺傳多樣性都較低。以往研究結果表明，繁育系統(tǒng)、分布范圍、生活型、分類地位、種子散播機制在種群水平上對遺傳變異的影響呈下降趨勢（Hamrick et al， 1989），繁育系統(tǒng)可同時影響種群和物種水平上的遺傳變異。一般來說，分布范圍廣、壽命長、風媒授粉、異交為主、結實性高且存在于演替末期群落中的物種具有較高的遺傳變異（Korron， 1987）。小花異裂菊分布在廣西陽朔縣，其分布范圍的地理跨度較小，主要分布于石灰?guī)r石山上部向陽的狹小范圍內(nèi)，無論是光照、濕度、溫度、土壤量等都相差不大，造成各局域生境因子的較小差異。此外，小花異裂菊的繁育系統(tǒng)為異交、部分自交親和在長期進化過程自交程度隨著種群的減小而呈加劇趨勢。因此，生境片段化和自交繁育系統(tǒng)可能是使得小花異裂菊在物種水平上具有較低水平的遺傳多樣性的主要原因。

3.2 小花異裂菊種群的遺傳分化

小花異裂菊種群間基因分化系數(shù)Gst為0.690 5，總的遺傳變異中有69.05%來自于種群間，表明種群間發(fā)生了較大程度的遺傳分化。Wright （1965）提出可根據(jù)種群每代遷移數(shù)（Nm）的大小來判斷種群間遺傳分化的主要原因。根據(jù)基因流估算值的大小，分為高、中、低三個水平（Govindardju et al， 1988）。種群間的基因分化與基因流Nm的數(shù)值呈負相關，大的基因流可以阻止種群之間的遺傳分化。小花異裂6個種群的基因流僅為0.224 2，遠小于1，基因流呈低水平。

一般來說木本植物基因流的大小主要決定于花粉流或種子流（Ennos，1994）。據(jù)觀測，小花異裂菊的繁育系統(tǒng)為異交、部分自交親和、需傳粉者。小花異裂菊開花期山頂溫度可以高達40 ℃左右且持續(xù)時間長，光照強烈，白天和夜晚的風速都相對較高。在強風和高溫作用下柱頭表面干燥和花蜜蒸發(fā)速度加快，花粉對傳粉者的吸引力降低，使傳粉者的活動減少。氣象因素的變化還會影響訪花者的種類和數(shù)量。這些因素使小花異裂菊具有不穩(wěn)定的傳粉環(huán)境。小花異裂菊各種群呈片段化分布，花粉難以通過風媒或傳粉者在水平地理、垂直距離都較遠的種群間進行有效的傳播，不同種群間相互傳粉受精幾率愈來愈小，不利于種群之間、分布區(qū)域之間的基因交流。小花異裂菊種群的植株數(shù)量一般在10～50之間，其中只有部分開花，昆蟲隨機的訪花方式極易引起同株異花授粉，從而導致自交。小花異裂菊自然分布十分狹窄，種群規(guī)模很小，長期的自交在一定程度上導致種群遺傳多樣性降低。

野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)小花異裂菊雖然結實率很高，但種子萌發(fā)率極低。其次小花異裂菊幼苗分布地多位于植被的底層，光照度低，弱光導致幼苗生長異常，生存能力降低，種群的自然更新能力較差。以上因素造成小花異裂菊種群個體數(shù)量日益縮小。50個個體為維持足夠等位基因豐度的最小有效種群的個體數(shù)， 500個個體才能保證維持種群內(nèi)數(shù)量性狀的遺傳變異和種群對不斷變化的環(huán)境的適應能力。我們在野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小花異裂菊絕大多數(shù)種群中的個體在3～100之間，遠遠低于可維持種群遺傳多樣性的有效規(guī)模。種群個體數(shù)量的不斷減小必然導致小花異裂菊遺傳多樣性的喪失（Franke et al， 1995）。

一般來說，植物的多樣性中心可能是該物種的起源中心（Vavilov，1930），因此YS種群可能是小花異裂菊的部分起源中心。YS位于6個種群的中間位置，與其他種群有相對較大的基因流交流，基因重組的空間和機會更大，更易擴大種群的遺傳多樣性水平。UPGMA聚類結果顯示，YS和GT，BS和YD，XP和PY親緣關系相對較近，來自于相近地理生態(tài)型的種群可以聚于一類，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律。這可能是產(chǎn)期自然選擇使個體中發(fā)生的不定向變異演變?yōu)槿后w遺傳結構的定向變異（張懷山等，2014），再加上長期的自交等因素，導致同一地區(qū)的大部分個體基因型趨于相似的結果。

3.3 保護措施

建議采取以下措施對小花異裂菊資源進行保護：（1）制止亂砍濫伐，保護的生境不被破壞。（2）提高基因雜合度。小花異裂菊受威脅最主要的內(nèi)在因素是其有性繁殖能力低，種群復壯最主要的途徑就是提高有性繁殖能力。因此，保存現(xiàn)有小花異裂菊種群面積或者人工促進種群內(nèi)與種群間的傳粉，增加后代的基因雜合度，可在很大程度上達到復壯種群的目的。（3）小花異裂菊種子萌發(fā)率和幼苗成活率都極低，在以后的研究中需加強對小花異裂菊種子育苗和管理技術的研究。

參考文獻：

BU J，WANG DM，LI DW， et al， 2012. ISSR analysis on diversity and genetic relationship in germplasm resources of wild Polygonatum odoratum from different habitats [J]. Chin Trad Herb Drugs， 43（9）：1824-1828. [卜靜，王冬梅，李登武， 等， 2012. 不同產(chǎn)地野生玉竹種質(zhì)資源多樣性與親緣關系的ISSR分析 [J]. 中草藥， 43（9）：1824-1828.]

CHAI SF，ZHUANG XY，ZOU R，et al， 2014. Genetic diversity analysis of endangered plant Camellia pubipetala detected by ISSR [J]. Acta Bot BorealOccidental Sin， 34（1）：93-98. [柴勝豐，莊雪影鄒蓉，等， 2014. 瀕危植物毛瓣金花茶遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 西北植物學報， 34（1）：93-98.]

CHEN YL， 1985. An endemic and endangered genus Heteroplexis Chang from Guangxi [J]. Guihaia， 5（4）：337-343. [陳藝林， 1985. 廣西特有和瀕危的異裂菊屬 [J]. 廣西植物， 5（4）：337-343.]

ENNOS RA， 1994. Estimatng the relative rates of pollen and seed migration among plant population [J]. Heredity， 72：250-259.

FAN XN， LIN S， ZHU CG， et al， 2010. Terpenoids of Heteroplexis micocephala and their bioactivities [J]. China J Chin Mat Med， 35 （3）： 315-322. [樊曉娜， 林生， 朱承根， 等， 2010. 小花異裂菊中的萜類成分及其活性 [J]. 中國中藥雜志， 35 （3）： 315-322.]

FRANKE OH， B ROWN AHD， BURDOU JJ， 1995. The conservatioon of plant biodiversity [M]. Cambridge MA：Cambridge University Press.

FU LG， 1992. Chinese plant red book [M]. Beijing：Science Press. [付立國， 1992. 中國紅皮書——稀有瀕危植物 [M]. 北京：科學出版社.]

GE YQ， QIU YX， DING BY， et al， 2003. An ISSR analysis on population genetic diversity of the relict plant Ginkgo biloba [J]. Biodivers Sci， 11（4）：276-287.

GOVINDARDJU DR， 1988. Relationship between dispersal ability and levels of gene fiow in plants [J]. Oikos， 52：31-35.

HAMRICK JL， GODT MJW， 1989. Allozyme diversity in plant species [M]// BROWN ADH， CLEGG MT， KAHLER AL， et al. Plant population genetics， breeding and genetic resources. Sunderland：Sinauer Press.

HUANG SX， LUO WH， TANG WX， et al， 2002. Study on the adaptability of the rare and threatened limestone plants exsitu conservation [J]. Guihaia， 22（02）： 136-139. [黃仕訓， 駱文華， 唐文秀， 等， 2002. 石山稀有瀕危植物遷地保護適應性研究 [J]. 廣西植物， 22（02）： 136-139.]

KORRON JD， 1987. A comparison of levels of genentic polymorphism and selfcompatibility： geographically restricted and widespread plant congeners [J]. Ecology， 1（1）：47-58.

LI A，GE S， 2002. Advances in plant conservation genetics [J]. Biodivers Sci，10（1）：61-71. [李昂，葛頌， 2002. 植物保護遺傳學研究進展 [J]. 生物多樣性，10（1）：61-71.]

LIANG JY， 1994. Two new species of Heteroplexis Chang（Compositae） [J]. Guihaia， 14（02）： 126-129. [梁健英， 1994. 異裂菊屬兩新種 [J]. 廣西植物， 14（02）： 126-129.]

MO WJ，F(xiàn)U JM，QIAO J，et al， 2013. ISSR study on genetic relationship of genus Paulownia [J]. Sci Silv Sin， 49（1）：61-67. [莫文娟，傅建敏，喬杰，等， 2013. 泡桐屬植物親緣關系的ISSR分析 [J]. 林業(yè)科學， 49（1）：61-67.]

NYBOM H， BARTICH IV， 2000. Effects of life history traits and sampling strategies on genentic diversity estimates obtained with RAPD marks in plants perspectives in plant ecology [J]. Evol Syst， 3（2）：93-114.

QIN HN， LIU Y ， 2010. A checklist of vascular plants of Guangxi [M]. Beijing：Science Press. [覃海寧， 劉演 ， 2010. 廣西植物名錄 [M]. 北京：科學出版社.]

RICHTER TS， SOLTIS PS， SOLTIS DE，1994. Genetic variation within and among population of the narrow eddemic Delphinium viridescens [J]. Am J Bot， 81：1070-1076.

SHI YC，ZOU R，LUO WH，et al， 2012. Establishment and optimization of the ISSR reaction system for Heteroplexis sericophylla Y. L. Chen [J]. Seed，31（9）：34-37. [史艷財，鄒蓉，駱文華，等， 2012. 廣西特有植物小花異裂菊ISSRPCR 反應體系的建立 [J]. 種子，31（9）：34-37.]

VAVILOV NI， 1930. Wild progenitors of the fruit tress of Turkistan and the Caucasus and the problem of the origin of fruit trees [M]. London：Pocr Gtb Int Hort Cong.

WRIGHT， 1965. The interpretation of population structure by F statistics with special regard to system of mating [J]. Evolution， 19：395-420.

ZIETKIEWICZ E， RAFALSKIA L， 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR） anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics， 20： 176-183.

ZHANG GL， GUO X， 2002. The karyotype analysis of Anemoclema glaucifolium and Heteroplexis microcephala both endemic to China [J]. Acta Bot Yunnan， 24（6）： 765-768. [張國莉， 龔洵， 2002. 中國特有罌粟蓮花和小花異裂菊的核型分析 [J]. 云南植物研究， 24（6）： 765-768.]

ZHANG HS， XIA ZR，LI MF， et al， 2014. Genetic diversity of Pennisetum longissimum var. intermedium germplasm resources using ISSR markers [J]. Acta Bot BorealOccident Sin， 34（2）：256-264. [張懷山， 夏增潤，栗孟飛，等， 2014. 中型狼尾草種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 西北植物學報， 34（2）：256-264.]

ZHANG J， WANG J， LI HY，et al， 2012. Genetic diversity of different ecogeographical populations in endangered plant Prunus mongolica by ISSR Markers [J]. Acta Ecol Sin，32（14）：4443-4452. [張杰， 王佳， 李浩宇，等， 2012. 瀕危植物蒙古扁桃不同地理種群遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 生態(tài)學報，32（14）：4443-4452.]