李光河

（廣東省深圳市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518020）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

液相色譜－質(zhì)譜法測(cè)定丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷含量

李光河

（廣東省深圳市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518020）

目的 建立測(cè)定丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷含量的液相色譜－質(zhì)譜法(LC－MS／MS)。方法 待測(cè)樣品用0.1 mol／L NaOH甲醇溶液室溫靜置后超聲提取，色譜柱采用Agilent SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)；質(zhì)譜采用ESI源正離子－MRM模式下檢測(cè)，選擇離子對(duì)為807.2～627.4，流速為0.4mL／min。結(jié)果黃芪甲苷質(zhì)量濃度在5.1～76.5 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.42%，RSD＝3.34%（n＝6）。結(jié)論 該方法適用于測(cè)定丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷的含量，同時(shí)可為丹溪玉屏風(fēng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

丹溪玉屏風(fēng)顆粒；益母草堿；液相色譜－質(zhì)譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

丹溪玉屏風(fēng)顆粒收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)[1]，由黃芪、白術(shù)(炒)、防風(fēng)組方，具有益氣、固表、止汗的功效。方中黃芪善補(bǔ)氣、固表、止汗，為方中君藥。黃芪甲苷為黃芪的重要的活性成分，具有降壓、消炎、抗衰老、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等作用[2－4]，故測(cè)定黃芪甲苷對(duì)于丹溪玉屏風(fēng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立具有重要意義。由于皂苷類成分在紫外區(qū)下有末端吸收，目前，多采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）法測(cè)定丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷的含量[5]。本研究中參考文獻(xiàn)[6－7]，建立液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS／MS）法測(cè)定丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷的含量，目的在于建立一個(gè)簡單、快速的定量方法，為丹溪玉屏風(fēng)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提高準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Agilent 6410三重四極桿質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；超聲波儀(上海冠特超聲儀器有限公司)；MS104S電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥

丹溪玉屏風(fēng)顆粒（云南白藥股份集團(tuán)有限公司，批號(hào)為 ZAB1637，ZDB1611，ZGB1615）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110781－201314，含量為95.8%）；甲醇(色譜純，Sigma試劑公司)；氫氧化鈉（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量(以黃芪甲苷計(jì)10.2mg)，精密稱定，置100m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成貯備液Ⅰ；從貯備液Ⅰ中吸取1.0 mL溶液，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成貯備液Ⅱ；從貯備液Ⅱ中吸取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5mL溶液，置100mL容量瓶中，用甲醇稀釋制成系列對(duì)照品溶液Ⅰ－Ⅶ。

供試品溶液：取丹溪玉屏風(fēng)顆粒，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，加入含0.1mol／LNaOH的甲醇50m L，室溫靜置2 h后，稱重，超聲30min后放置，冷卻至室溫，稱重，以甲醇補(bǔ)足失重。于離心機(jī)中離心5min (轉(zhuǎn)速為 4 000 r／min)，精密吸取上清液 1.0 m L置于100mL容量瓶，流動(dòng)相定容，搖勻，微孔濾膜，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例取缺黃芪的其余藥味，制備缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法得陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent SB－C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)；流速：0.4m L／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；分析時(shí)間：5.0 min。質(zhì)譜采用 ESI源正離子－MRM模式。離子對(duì)：807.2～627.4；霧化器壓力：35.0 psi；干燥氣流速：8.0 L／min；干燥氣溫度：450℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；四極桿溫度：100℃。在擬訂色譜條件下，陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖1。可見，陰性對(duì)照品溶液對(duì)樣品測(cè)定無干擾。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取系列對(duì)照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得黃芪甲苷回歸方程 A＝2.07×102ρ＋2.47×102，r＝0.999 4。結(jié)果表明，黃芪甲苷質(zhì)量濃度在5.1～76.5 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：吸取系列對(duì)照品溶液Ⅴ，在擬訂色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果黃芪甲苷樣品峰面積分別為6 022.0，6 125.0，6 238.0，6 488.0，6 235.0，6 378.0，RSD為2.7%(n＝6)，表明儀器精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取丹溪玉屏風(fēng)顆粒2.0 g，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果黃芪甲苷含量分別為 70.81，71.76，70.24，71.42，68.85，68.41μg／g，RSD為2.0%(n＝6)，表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取同一批丹溪玉屏風(fēng)顆粒2.0 g，按供試品溶液制備方法制備溶液1份，置室溫條件下，分別于0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果黃芪甲苷樣品含量分別為 72.52，73.29，68.85，73.23，70.30μg／g，RSD為2.8%(n＝5)，表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量供試品約1.0 g，精密稱定，分別加入貯備液Ⅰ0.7mL，依法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

取丹溪玉屏風(fēng)顆粒3批，每批3份，按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算上述樣品的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 LC－M S／M S法選擇

由于黃芪甲苷在紫外區(qū)下有末端吸收，會(huì)影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。藥典中采用HPLC－ELSD法測(cè)定含量[5－8]，但缺點(diǎn)是靈敏度低、信號(hào)不穩(wěn)定、重現(xiàn)性較差。參考文獻(xiàn)[9－13]，選擇靈敏度較高、信號(hào)穩(wěn)定的LCMS／MS法測(cè)定黃芪甲苷的含量。在條件篩選中曾經(jīng)比較正、負(fù)離子模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用正離子模式較負(fù)離子模式黃芪甲苷的信號(hào)強(qiáng)，基線降低，故最終確定正離子模式測(cè)定。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表2 丹溪玉屏風(fēng)顆粒中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果

3.2 流動(dòng)相條件選擇

由于質(zhì)譜條件選擇的是正離子模式，故流動(dòng)相選擇甲醇作為有機(jī)相，因?yàn)榧状贾械牧u基能給出1個(gè)氫離子，有助于黃芪甲苷的解離；同時(shí)在流動(dòng)相中加入一定量的有機(jī)酸也能促使黃芪甲苷的解離，嘗試加入甲酸和乙酸，發(fā)現(xiàn)加入甲酸后黃芪甲苷色譜峰響應(yīng)值高、柱效好，故選擇加入0.1%的甲酸?？紤]到黃芪甲苷的極性后經(jīng)過調(diào)整，確定甲醇－0.1%甲酸水溶液(70∶30)，黃芪甲苷保留時(shí)間在3.5min，整個(gè)分析時(shí)間控制在5min內(nèi)，可大大地縮短分析時(shí)間。

3.3 提取條件選擇

自然界中黃芪甲苷單體在黃芪藥材中的含量較低，黃芪藥材中含量較高的成分為黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ等。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ經(jīng)過皂化反應(yīng)脫去乙?；拍苻D(zhuǎn)化為黃芪皂苷，參考文獻(xiàn)[2，14－15]后，現(xiàn)在室溫條件下用含0.1 mol／L NaOH的甲醇50 mL，室溫靜置2 h，充分發(fā)生皂化反應(yīng)后，再用超聲提取，皂化反應(yīng)充分，提取率較高。同時(shí)，比較不同的堿化試劑，最后確定用0.1 mol／L NaOH皂化反應(yīng)充分；比較超聲提取、加熱回流方法，最后發(fā)現(xiàn)超聲提取法簡便易操作，且提取率較高。故選用含0.1mol／LNaOH的甲醇50m L，室溫靜置2 h，充分發(fā)生皂化反應(yīng)后，再用超聲提取。

3.4 穩(wěn)定性考察

僅考察了樣品處理后在室溫條件下放置8 h內(nèi)的穩(wěn)定性，原因?yàn)楸驹囼?yàn)中方法學(xué)考察時(shí)間大約為7 h，所以本試驗(yàn)中只考察了室溫放置8 h的穩(wěn)定性。樣品是否能在更長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，本試驗(yàn)中未進(jìn)行繼續(xù)考察。

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Content Determ ination of Astragaloside in Danxi Yuping Feng G ranu le by LC－M S／MS

Li Guanghe
(Department of Pharmacy,Shenzhen City People′s Hospital,Shenzhen,Guangdong,China 518020)

Objective To establish an HPLC－MS／MS method for content determination of astragaloside in Danxi Yuping Feng Granule.M ethods The sample was tested by ultrasonic extraction with 0.1 mol／L NaOH methanol solution at room temperature after stewing, The chromatographic separation was achieved on a Agilent SB－C18column(150 mm×4.6 mm,5μm)with a mobile phase of methyl alcohol－0.1% formic aicd in water(70∶30).The flow rate was 0.4 m L／min.Results The calibration curve was linear within the range of 5.1－76.5 ng／mL for astragaloside.The recovery was 99.42%,RSD＝3.34%(n＝6).Conclusion The method is suitable for content determination of astragaloside,it can be used for the quality control of Danxi Yuping Feng Granule.

Danxi Yuping Feng Granule;astragaloside;HPLC－MS／MS;quality standard

2016－12－07；

2017－01－22)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.007

李光河(1978－)，男，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）jntj＿zgd＠163.com。

R284.1

A

1006－4931(2017)07－0021－03