舒 暢，范 強(qiáng)，楊麗霞，姜良恩，張邦能，康萬(wàn)榮，張延英，萬(wàn)生芳

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050)

·實(shí)驗(yàn)研究·

昆侖雪菊提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX的影響*

舒 暢1，范 強(qiáng)1，楊麗霞2，姜良恩1，張邦能3，康萬(wàn)榮1，張延英1，萬(wàn)生芳1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050)

目的：觀察昆侖雪菊提取物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量的影響。方法：將造模成功的35只雄性STZ誘導(dǎo)的糖尿病Wistar大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組和吡咯列酮組5組，每組7只；另選7只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)劑量灌胃，吡咯列酮組灌服吡咯列酮10 μg/(g·d)。連續(xù)4周。4周后，心包外抽血，離心取血清。檢測(cè)大鼠血清空腹血糖(FPG)、餐后2小時(shí)血糖(P2hPG)、胰島素(INS)、SOD、MDA、GSH-PX含量。結(jié)果：與模型對(duì)照組對(duì)比，昆侖雪菊提取物各劑量組大鼠體質(zhì)量降低不明顯(P>0.05)，但FPG和P2hPG降低，INS增高，其中昆侖雪菊提取物高劑量組作用明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，昆侖雪菊提取物組和吡咯列酮組大鼠MDA水平降低,SOD、GSH-PX水平升高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中昆侖雪菊提取物高劑量組與吡咯列酮組接近。結(jié)論：昆侖雪菊提取物在一定程度上具有降低2型糖尿病大鼠血糖、MDA水平，升高抗氧化酶SOD、GSH-PX水平，促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗的作用,其作用機(jī)制可能與其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

昆侖雪菊提取物/藥效學(xué)；2型糖尿??；血糖；氧化應(yīng)激；胰島素抵抗；動(dòng)物模型；大鼠

昆侖雪菊，植物學(xué)名是蛇目菊、金雞菊(Coreopsis)，因主要分布在我國(guó)新疆和田地區(qū)的昆侖山區(qū)，而得名為昆侖雪菊，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾的功效，是近年來(lái)開發(fā)的一種具有廣闊的市場(chǎng)前景和研究?jī)r(jià)值的新品種藥材[1]。臨床上，雪菊花及復(fù)方制劑已用于多種疾病的治療[2]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)、胰島β細(xì)胞受損是2型糖尿病發(fā)病的主要原因，高血糖、高血脂導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞線粒體在代謝過程中產(chǎn)生大量活性氧，使線粒體受損，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而激活細(xì)胞內(nèi)一系列應(yīng)激信號(hào)通路。這些應(yīng)激信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致胰島素作用通路的阻斷，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生及促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡等[3]。血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)具有清除活性氧、拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的作用。昆侖雪菊提取物的主要成分是黃酮類化合物[1]，有研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、降血壓、抗癌等生物活性和藥理作用[4]。本研究通過檢測(cè)糖尿病大鼠血糖及血清SOD、MDA、GSH-PX含量，探索抗氧化應(yīng)激反應(yīng)與2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

70只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，每天自由飲水、攝食。

1.2 藥品、試劑與儀器

昆侖雪菊，產(chǎn)地青海，購(gòu)于青海優(yōu)潤(rùn)堂商貿(mào)有限責(zé)任公司，由上海友思生物技術(shù)有限公司提取；鹽酸吡格列酮片，北京太洋藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130605。鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)046K1206。ELISA試劑盒：胰島素(INS)，批號(hào)CSB-E05070r，CUSABIO公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，貨號(hào)依次是A001-1，A003-1，A005。羅氏活力型血糖試紙，德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司產(chǎn)品。羅氏活力型血糖儀，德國(guó)Roche Diagnostics GmbH公司產(chǎn)品；2700型全自動(dòng)生化儀，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；Bio-rad 680型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常對(duì)照組7只外，其余大鼠均給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)；8周末尾靜脈注射STZ 25 μg/(g·d)；l周后尾靜脈取血測(cè)定血糖。隨機(jī)血糖穩(wěn)定>13.9 mmol/L者診斷為2型糖尿病；隨機(jī)血糖小于13.9 mmol/L的大鼠，追加注射STZ 25 μg/(g·d)繼續(xù)造模，并監(jiān)測(cè)血糖。連續(xù)兩次測(cè)隨機(jī)血糖>13.9 mmol/L者視為造模成功。

1.4 分組與給藥方法

造模成功后，隨機(jī)選取35只大鼠，隨機(jī)分為模型對(duì)照組，昆侖雪菊提取物低、中、高劑量組和吡格列酮組5組，每組7只。另選7只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服生理鹽水，昆侖雪菊提取低、中、高劑量組分別按100，200，400 μg/(g·d)劑量灌胃，吡咯列酮組灌服吡咯列酮10 μg/(g·d)，灌胃量為10 μL/g。所有藥品用生理鹽水配成所需的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，1 d 1次，連續(xù)4周。4周后，禁食8 h，麻醉后，一次性心臟采血，血液靜置2 h，以4 ℃、3 500 r/min離心20 min，取血清，-20 ℃保存待測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 一般情況及血糖

觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、毛色等一般情況，并稱體質(zhì)量，每周測(cè)空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(P2hPG)和胰島素(INS)。

1.5.2 血清SOD、MDA、GSH-PX含量

按照試劑盒說明書進(jìn)行。檢測(cè)前先對(duì)所有樣本進(jìn)行低溫離心，在反應(yīng)孔中加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本，每孔劑量為100 μL。在空白對(duì)照孔中加入稀釋液，劑量為100 μL；在37 ℃電熱培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育，孵育后對(duì)檢測(cè)板進(jìn)行洗滌；加酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)；反應(yīng)終止后，將檢測(cè)板在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。以空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)條件為450 nm，測(cè)定各孔OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠皮毛光澤，精神狀態(tài)表現(xiàn)良好，動(dòng)作反應(yīng)靈敏，行為活躍。模型對(duì)照組大鼠皮毛干枯無(wú)光澤，精神狀態(tài)較差，動(dòng)作遲緩，反應(yīng)較慢，活動(dòng)度差，并隨著飼養(yǎng)時(shí)間程度加重。昆侖雪菊提取物各劑量組和吡格列酮組與模型對(duì)照組對(duì)比，上述情況有不同程度的改善。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、FPG、P2hPG、INS水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量降低，F(xiàn)PG與P2hPG升高，并伴隨胰島素水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)昆侖雪菊提取物治療后，各組大鼠體質(zhì)量變化不明顯，但FPG與P2hPG有不同程度的降低，其中昆侖雪菊提取物高劑量作用最為顯著。與模型對(duì)照組對(duì)比，昆侖雪菊提取物各劑量組大鼠INS水平增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在降低FPG與P2hPG及促進(jìn)其胰島素分泌方面，高劑量昆侖雪菊提取物與吡咯列酮作用接近。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)體質(zhì)量/gFPG/(mmol·L-1)P2hPG/(mmol·L-1)INS/(μIU·L-1)正常對(duì)照組—432.1±43.14.30±0.206.05±0.4390.03±18.72模型對(duì)照組—220.0±28.5*26.20±3.80*30.90±1.60*19.41±19.36*吡咯列酮組10231.4±41.025.45±7.3323.95±3.1943.44±57.10#昆侖雪菊低劑量組100239.4±51.618.34±7.1127.74±3.8239.30±35.70#昆侖雪菊中劑量組200244.4±37.416.91±7.33#25.93±4.2435.37±42.38#昆侖雪菊高劑量組400238.3±32.016.73±4.97#23.65±6.7742.53±49.67#

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX水平對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠血清MDA水平升高(P<0.05)，而SOD、GSH-PX水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，昆侖雪菊提取物各劑量組與吡咯列酮組能降低大鼠血清MDA水平，增加SOD、GSH-PX水平。見表2。

組 別劑量/(μg·g-1)SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)GSH-PX/(U·mL-1)正常對(duì)照組—54.22±66.1720.60±11.682.84±29.10模型對(duì)照組—4.26±25.42*46.31±13.46*-9.21±8.29*吡咯列酮組1029.28±47.79#5.60±31.30#-6.75±5.32昆侖雪菊低劑量組1000.42±15.1834.17±26.33-6.05±7.33昆侖雪菊中劑量組2006.58±49.66#32.26±20.29#2.51±7.22#昆侖雪菊高劑量組40014.59±79.78#23.21±20.20#14.03±29.60#

注：與正常對(duì)照組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05。

3 討 論

糖尿病是一種與遺傳因素、自由基和免疫功能紊亂等多種致病因子相關(guān)的代謝紊亂綜合征，是人類健康的嚴(yán)重威脅之一[5]。目前，已有大量研究證實(shí)氧化應(yīng)激是糖尿病及其并發(fā)癥的共同發(fā)病途徑之一[6-7]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的自由基會(huì)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的凋亡，增加胰島素抵抗而引起胰島素分泌不足，使血糖升高并導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化[8-9]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其含量可以體現(xiàn)氧自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度[10]；SOD、GSH-PX通過清除超氧陰離子(O2-)而保護(hù)細(xì)胞免受損傷，它們的活性高低間接反映機(jī)體清除自由基的能力[11]，也就是機(jī)體抗氧化的能力。因此，SOD、GSH-PX具有減輕胰島素抵抗的作用。

從表1可以看出，與模型對(duì)照組對(duì)比，灌服昆侖雪菊提取物的各組大鼠FPG和P2hPG有不同程度的降低，其中昆侖雪菊提取物高劑量作用顯著；同時(shí)，灌服昆侖雪菊提取物的各組大鼠INS分泌顯著增加(P<0.05)。說明昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病癥狀改善有一定的作用。從表2可以看出，昆侖雪菊提取物組能顯著降低大鼠血清MDA水平(P<0.05)，增加SOD、GSH-PX水平(P<0.05),說明昆侖雪菊提取物能提高機(jī)體清除自由基的能力，即提高機(jī)體抗氧化的能力，從而通過保護(hù)胰島細(xì)胞，減輕胰島素抵抗，改善糖尿病癥狀。

綜上所述, 昆侖雪菊提取物可改善2型糖尿病大鼠的血糖水平和抗氧化能力；昆侖雪菊提取物可能是通過改善2型糖尿病大鼠的抗氧化機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗氧化功效。由于受藥物提取濃度、灌胃時(shí)間等因素影響，本課題還處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，缺乏深入性，且缺乏相應(yīng)的臨床研究，這將是本課題以后研究的重點(diǎn)，希望能為臨床防治糖尿病提供思路和依據(jù)。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)04-0070-03

R587.1

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.04.30

舒暢(1978-)，女(漢族)，重慶人，副教授，碩士,主要從事中醫(yī)藥防治糖尿病的研究。通信作者：楊麗霞，副主任醫(yī)師，博士,13038770310@163.com

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308RJZA106)；蘭州市科技局項(xiàng)目(2014-1-20)

2016-09-05；

2017-01-17