潘杰　林夢心　林炳鏘　徐宗斌

【摘要】 目的：探討轉(zhuǎn)錄共刺激因子（TAZ）對結(jié)直腸癌基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)增殖蛋白的影響，分析其影響結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為的可能作用機(jī)制。方法：采用合成TAZ小干擾RNA（TAZ-siRNA）轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCTT116抑制TAZ表達(dá)，檢測細(xì)胞活性、侵襲遷移能力、細(xì)胞凋亡，采用實(shí)量定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測TAZ與基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)，采用Western blot法相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：轉(zhuǎn)染組TAZ mRNA與蛋白表達(dá)均明顯低于對照組與空白組（t=27.116、17.600、24.051、16.168，P<0.01）；HCT116細(xì)胞活性、侵襲遷移能力均明顯低于對照組與空白組，細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組與空白組（t=12.944、17.613、20.489、12.639、18.324、20.051，P<0.01）；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等mRNA表達(dá)均明顯低于對照組與空白組，金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）mRNA表達(dá)均明顯高于對照組與空白組（t=13.588、10.041、6.678、13.164、10.479、6.705，P<0.05或<0.01）；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）蛋白表達(dá)均明顯低于對照組與空白組，bcl-2相關(guān)X蛋白（bax）、細(xì)胞色素C（Cyt C）表達(dá)均明顯高于對照組與空白組（t=9.358、7.670、15.205、19.163、5.937、17.063，P<0.05或<0.01）。結(jié)論：抑制轉(zhuǎn)錄共刺激因子（TAZ）能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶、相關(guān)蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； 轉(zhuǎn)錄共刺激因子； 金屬蛋白酶； 增殖蛋白

Impact of Matrix Metalloprotein and Proliferin of TAZ for Colorectal Cancer/PAN Jie，LIN Meng-xin，LIN Bing-qiang，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：030-033

【Abstract】 Objective：To study the effect of matrix metalloprotein and proliferin of TAZ for colorectal cancer，and analyzed possible mechanisms of colorectal cancer biological behavior.Method：Using TAZ-siRNA transfection colorectal cancer cell line HCTT116 inhibits TAZ expression，and cell activity，attack mobility，apoptosis，TAZ and matrix metal protease mRNA expression，related protein expression were tested.Result：Transfection groups TAZ mRNA and protein expression were significantly lower than those of the control group and the blank group（t=27.116，17.600，24.051，16.168；P<0.01）.HCT116 cell activity，attack mobility ability were significantly lower than those of the control group and the blank group，apoptosis rate was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=12.944，17.613，20.489，12.639，18.324，20.051；P<0.01）.MMP-2，MMP-9 mRNA expression were significantly lower than those of the control group and the blank group，TIMP-1 mRNA expression was significantly higher than those of the control group and the blank group（t=13.588，10.041，6.678，13.164，10.479，6.705；P<0.05 or<0.01）.Bcl-2 protein expression was significantly lower than those of the control group and the blank group，bax，Cyt C expression were significantly higher than those of the control group and the blank group（t=9.358，7.670，15.205，19.163，5.937，17.063；P<0.05 or <0.01）.Conclusion：TAZ can inhibit tumor cell proliferation and metastasis of colorectal cancer，it may be related to regulating the substrate metal protease and related protein expression levels.

【Key words】 Colorectal cancer； TAZ； Matrix metalloprotein； Proliferin

First-authors address：Fujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.008

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）位居腫瘤相關(guān)死亡的第3位，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，盡管西妥昔單抗等靶向藥物不斷應(yīng)用于臨床，但5年生存率仍不足70%[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，近期研究表明，具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ binding motif，TAZ）具有原癌基因特征，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、導(dǎo)致細(xì)胞癌變[2-3]，在結(jié)直腸癌組織中呈異常高表達(dá)現(xiàn)象[4]。有關(guān)TAZ對結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為影響的文獻(xiàn)報道較少，本文通過抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞TAZ表達(dá)的方法，分析TAZ對結(jié)直腸癌基質(zhì)金屬蛋白酶及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，旨在分析其結(jié)直腸癌腫瘤生物學(xué)行為影響的可能作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株：福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）試劑盒：美國Promga公司；Trizol Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑：美國Invitrogen公司；PCR引物與小干擾RNA：武漢博士德生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒：廣州健侖生物科技有限公司；凋亡染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測試劑盒：日本Dojindo公司；TAZ、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相關(guān)X蛋白（bax）、細(xì)胞色素C（Cyt C）：美國Santa Cruz公司。癌組織標(biāo)本選擇2015年7-12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除結(jié)直腸癌患者20例，術(shù)前均未行放化療。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與TAZ小干擾RNA（TAZ-siRNA）轉(zhuǎn)染 常規(guī)將HCT116細(xì)胞株置入DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)。siRNA濃度調(diào)節(jié)為80 nmol/L，將細(xì)胞密度2×105/mL的HCT116細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h，參照說明書混合靜置轉(zhuǎn)染24 h觀察轉(zhuǎn)染效果。siRNA序列：TAZ：5-GCCACAUCUGGAACCUGAAGUUGAU-3；對照：5-GACGAGTTGACTGCGATTG3。

1.3 細(xì)胞活性 采用CCK-8法檢測，將2×105/mL

密度HCT116細(xì)胞接種到96孔板，生長至60%～80%時轉(zhuǎn)染siRNA，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)48 h后，加10 μL的CCK-8孵育2 h。采用全波段酶標(biāo)儀（450 nm處）測定吸光度，連續(xù)3次。

1.4 細(xì)胞侵襲遷移能力 參照王紅鈺等[5]文獻(xiàn)資料，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測量細(xì)胞侵襲遷移能力。

1.5 細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，使用結(jié)合緩沖液（500 μL）懸浮細(xì)胞，加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和10 μL碘化丙錠混勻，孵育15 min，采用流式細(xì)胞法（FCM）測定細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 TAZ與基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)錄48 h后提取細(xì)胞總RNA，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后于RT-qPCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min→95 ℃變性30 s→72 ℃退火30 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。通過PCR反應(yīng)曲線獲取閾值循環(huán)數(shù)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)量。各引物序列。

轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，加入一抗、二抗孵育，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑法檢測蛋白水平變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用方差分析或t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAZ mRNA與TAZ蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染組TAZ mRNA與蛋白表達(dá)均明顯低于對照組與空白組（P<0.01），對照組與空白組TAZ mRNA與蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見

2.2 TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染對HCT116細(xì)胞活性、侵襲、凋亡的影響 轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞活性、侵襲遷移能力明顯均低于對照組與空白組，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組與空白組（P<0.01）。對照組與空白組細(xì)胞活性、細(xì)胞侵襲遷移能力、細(xì)胞凋亡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染對bcl-2等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染組bcl-2蛋白表達(dá)明顯低于對照組與空白組，bax、Cyt C表達(dá)均明顯高于對照組與空白組（P<0.05或<0.01）；對照組與空白組bcl-2、bax、Cyt C等表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

Hippo信號通路是一條高度保守的細(xì)胞生長抑制性信號通路，作為Hippo通路的主要效應(yīng)分子，TAZ在組織細(xì)胞分化、發(fā)育及生長中具有重要作用[6-7]。相關(guān)研究表明，TAZ在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)約20%，其表達(dá)水平與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)[8-9]；在MCF7、Hs578T細(xì)胞中，沉默TAZ的表達(dá)可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[10-11]；在裸鼠成瘤中，抑制TAZ的表達(dá)同樣明顯降低了乳腺腫瘤細(xì)胞的成瘤率[12]。曾長青等[13]研究報道，TAZ在結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與TNM分期、腫瘤大小、浸潤深度明顯相關(guān)，認(rèn)為TAZ是一個潛在的結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)。

RNA干擾是雙鏈RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，可有效降解靶基因mRNA，是研究腫瘤治療與基因功能的有效方法[14]。本研究中，采用RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株中TAZ的mRNA與蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活性、侵襲遷移能力均明顯低于對照組與空白組（P<0.05），細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組與空白對照組（P<0.05）。提示抑郁結(jié)直腸癌TAZ表達(dá)水平可降低腫瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞細(xì)胞凋亡，王紅鈺等[15]也有類似的文獻(xiàn)報道。

相關(guān)研究表明，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，其中腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)侵襲能力發(fā)揮著重要的作用[16]，文獻(xiàn)[17-18]報道結(jié)直腸浸潤邊緣發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9、TIMP-1，其中MMP-2、MMP-9能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，TIMP-1可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[17-18]。

本研究中，抑制結(jié)直腸癌TAZ表達(dá)水平后，

TAZ-siRNA轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9等mRNA表達(dá)均明顯降低，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯升高，提示抑制結(jié)直腸癌TAZ表達(dá)水平能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移。bcl-2、bax Cyt C均是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡的重要蛋白[19-20]，這也可以從三組bcl-2、bax Cyt C蛋白表達(dá)水平比較中得到證實(shí)。

綜上所述，抑制結(jié)直腸癌TAZ表達(dá)水平有助于抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶與相關(guān)蛋白細(xì)胞表達(dá)水平等因素有關(guān)，其具體作用機(jī)制尚待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]胡文斌，張婷，史建國，等.江蘇省昆山市1981-2014年結(jié)直腸癌死亡趨勢分析[J].腫瘤防治雜志，2016，43（7）：623-628.

[2] Pathak S，Meng W J，Zhang H，et al.Tafazzin protein expression is associated with tumorigenesis and radiation response in rectal cancer：a study of Swedish clinical trial on preoperative radiotherapy[J].PLoS One，2014，9（5）：E98 317.

[3]呂柏楠，石曉明，吳勝春，等.水通路蛋白-5對結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制[J].河北醫(yī)藥，2015，37（3）：346-348.

[4] Wang L，Shi S，Guo Z，et al.Overexperession of YAP and TAZ is an independent predictor of progosis in colorectal cancer and realted to the proloferation and metastasis of colon cancer cells[J].PLoS One，2013，8（6）：e65 539.

[5]王紅鈺，王愛軍，徐晉珩，等.轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ對結(jié)腸癌細(xì)胞生長因子和侵襲遷移能力的影響及機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)外科雜志，2014，31（9）：1947-1950.

[6] Nagashima S，Maruyama J，Kawano S，et al.Validation of chemical compound library screening for transcriptional co-activator with PDZ-binding motif inhibitors using GFP-fused transcriptional co-activator with PDZ-binding motif[J].Cancer Sci，2016，107（6）：791-802.

[7] Yuen H F，McCrudden C M，Huang Y H，et al.TAZ expression as a prognostic indicator in colorectal cancer[J].PLoS One，2013，8（1）：e54 211.

[8]閆冰，盧穎，張春影，等.Hippo-TAZ信號通路在乳腺癌及乳腺癌干細(xì)胞中的作用[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2016，43（10）：779-782.

[9] Diamantopoulou Z，White G，F(xiàn)adlullah M Z H，et al.TIAM1 Antagonizes TAZ/YAP Both in the Destruction Complex in the Cytoplasm and in the Nucleus to Inhibit Invasion of Intestinal Epithelial Cells[J].Cancer Cell，2017，S1535-6108（17）：30 103-30 104.

[10]左錢飛，白艷濤，李佳樂，等.YAP/TAZ對發(fā)育和的調(diào)控及其功能研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（2）：379-381.

[11] Santucci M，Vignudelli T，F(xiàn)errari S，et al.The Hippo Pathway and YAP/TAZ-TEAD Protein-Protein Interaction as Targets for Regenerative Medicine and Cancer Treatment[J].J Med Chem，2015，58（12）：4857-4873.

[12] Chan S W，Lim C J，Guo K，et al.A role for TAZ in migration， invasion， and tumorigenesis of breast cancer cells[J].Cancer Res，2008，68（8）：2592-2598.

[13]曾長青，黃良祥，鄭羽，等.PDZ結(jié)合域轉(zhuǎn)當(dāng)共激活因子在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華胃腸外科雜志，2015，18（11）：1154-1157.

[14] Ji Y，Di W，Yang Q，et al.Inhibition of Autophagy Increases Proliferation Inhibition and Apoptosis Induced by the PI3K/mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 in Breast Cancer Cells[J].Clin Lab，2015，61（8）：1043-1051.

[15]王紅鈺，王愛軍，徐晉珩，等.抑郁具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)當(dāng)共刺激因子表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡的影響及機(jī)制[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33（3）：604-606.

[16]劉亞彬，鄭萬磊，張靜，等.華北地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險與基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)及基因多態(tài)性的相關(guān)性[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2017，34（1）：14-16.

[17]丁峰，楊夙，王巍，等.肝細(xì)胞癌RhoE和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)及意義[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（4）：916-917.

[18] Fuksiewicz M，Kotowicz B，Rutkowski A，et al.The matrix metalloproteinase-7 and pro-enzyme of metalloproteinase-1 as a potential marker for patients with rectal cancer without distant metastasis[J].Tumour Biol，2015，36（5）：3629-3635.

[19]陳超，于洪沛，吳浩榮，等.B淋巴細(xì)胞瘤-2基因通路阻斷對增加HepG2細(xì)胞化療敏感性的研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（10）：2608.

[20]馮俊偉，張志勇，王愛軍，等.結(jié)直腸癌組織中TAZ表達(dá)與Bcl-2、Bax、Caspase-3的關(guān)系及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志，2014，34（19）：5419-5420.

（收稿日期：2017-05-10） （本文編輯：程旭然）