張小琴，苗學(xué)蒸，周麗英，許力偉，賴文芳，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

紅景天苷對局灶性腦缺血/再灌注大鼠軸突再生及Akt/GSK-3β/CRMP-2表達的影響

張小琴，苗學(xué)蒸，周麗英，許力偉，賴文芳，洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

目的研究紅景天苷對局灶性腦缺血/再灌注大鼠軸突再生的影響及可能的機制。方法健康成年♂ SD大鼠36只，隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、紅景天苷給藥組，用線栓法建立局灶性腦缺血/再灌注大鼠模型(MCAO)，Zea-Longa標(biāo)準評分法評價大鼠神經(jīng)功能損傷，Western blot法檢測大鼠缺血側(cè)腦組織p-Akt(Ser473)、Akt、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β、p-CRMP-2(Thr514)、CRMP-2蛋白的表達，免疫熒光染色法檢測大鼠缺血側(cè)腦組織NF200蛋白的表達。結(jié)果與MCAO組比較，紅景天苷能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能損傷，促進NF200、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表達，抑制p-CRMP-2蛋白表達。結(jié)論紅景天苷能改善局灶性腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損，此作用可能與促進Akt、GSK-3β的磷酸化，抑制CRMP-2的磷酸化，進而促進軸突再生有關(guān)。

紅景天苷；局灶性腦缺血/再灌注；軸突再生；Akt；GSK-3β；CRMP-2

紅景天為景天科植物大花紅景天[Rhodiolacrenulata(Hook.f. et Thoms.) H.Ohba]的干燥根和根莖。具有益氣活血、通脈平喘的功效，用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘[1]。紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天的主要有效成分，課題組前期研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能降低局灶性腦缺血/再灌注大鼠(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的腦梗死體積和神經(jīng)功能損傷。本研究旨在觀察紅景天苷對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)、缺血側(cè)腦組織神經(jīng)微絲蛋白200(neurofilament protein 200，NF200)及Akt/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(collapsin response mediator protein-2，CRMP-2)蛋白表達的影響，進一步探索紅景天苷對MCAO模型大鼠神經(jīng)保護的可能機制，為紅景天苷開發(fā)治療急性腦缺血疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物健康成年♂ SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量(240～280) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2007000509960，許可證號：SCXK(滬)2007-0005，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.2藥物與試劑紅景天苷(批號：20151111，福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研發(fā)中心，純度>98%)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0010)；5×蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號P0015)；預(yù)染蛋白Marker(美國賽默飛世爾科技有限公司，貨號26616)；兔抗p-Akt(Ser 473)、兔抗Akt、兔抗p-GSK-3β(Ser 9)、兔抗GSK-3β、兔抗p-CRMP-2(Thr 514)、兔抗CRMP-2、兔抗GAPDH(美國CST公司，貨號分別為：4060、4685、9336、9315、9397、9393、2118)；兔抗NF200(美國Sigma公司，貨號N4142)；山羊抗兔二抗(美國賽默飛世爾科技有限公司，貨號31460)；FITC標(biāo)記山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZF-0311)。

1.3儀器ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)； PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot小型轉(zhuǎn)印槽(美國Bio-rad公司)；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；HM325石蠟切片機(美國Thermo Fisher公司)；LSM710激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；Primo R高速臺式冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技有限公司)；SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司)。

2 方法

2.1造模、分組及給藥實驗前大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔麻醉，參照本課題組前期的實驗方法[2-4]進行造模，沿頸部正中切開皮膚，暴露右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，眼科剪將頸總動脈剪個小口，插入線栓至頸內(nèi)動脈，插入深度距動脈分叉約2 mm，結(jié)扎頸內(nèi)動脈。栓塞2 h后，將線栓拔出。假手術(shù)組(Sham)進行相同的操作，除了不栓塞中腦動脈。采用Longa評分，神經(jīng)功能缺損評分在1～3分的為模型成功，可納入實驗。將成模的大鼠隨機分為模型對照組(MCAO)和紅景天苷給藥組(MCAO+Sal)，每組12只。MCAO+Sal 組腹腔注射紅景天苷(50 mg·kg-1)，連續(xù)6 d，末次給藥2 h后，取腦用于實驗。Sham組及MCAO組同法給予等量生理鹽水。

2.2神經(jīng)功能評分按照Zea-Longa神經(jīng)行為缺損評分標(biāo)準對大鼠進行評價。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：提尾時右前肢內(nèi)收，不能完全伸展；2分：自發(fā)行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時身體向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。評分過程至少由2人參與完成。

2.3Westernblot法檢測大鼠缺血側(cè)腦組織p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、p-CRMP-2、CRMP-2的蛋白表達將各組大鼠缺血側(cè)腦組織取下，液氮速凍，-80 ℃保存。提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h，p-Akt(Ser 473)、Akt、p-GSK-3β(Ser 9)、GSK-3β、p-CRMP-2(Thr 514)、CRMP-2 一抗(均為1 ∶1 000)4℃過夜，山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1.5 h，加 ECL 試劑經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測，分析目標(biāo)條帶的灰度值，計算各給藥組與空白對照組灰度值的比值，并統(tǒng)計各組之間的差異。

2.4免疫熒光染色法檢測缺血側(cè)腦組織NF200蛋白表達10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)深度麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈并固定，右心耳剪一小洞放血，先快速灌注生理鹽水250 mL沖去全身血液，后4%多聚甲醛溶液(pH 7.4)灌流固定，直至大鼠全身僵硬、強直，立即斷頭取腦，置于4℃ 4%多聚甲醛溶液繼續(xù)固定24 h[5]，再進行后續(xù)的常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5 μm，貼于防脫載玻片上，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)15 min，5% BSA(含10%山羊血清)封閉2 h，兔抗NF200(1 ∶80) 4℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶100)室溫1.5 h，DAPI復(fù)染核5 min，抗熒光淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

3 結(jié)果

3.1紅景天苷對MCAO大鼠神經(jīng)功能評分的影響如Fig 1所示，與sham組比較，MCAO組大鼠神經(jīng)功能評分較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與MCAO組比較，紅景天苷給藥6 d后，神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05)。

3.2紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織p-Akt、p-GSK-3β、p-CRMP-2蛋白表達的影響如Fig 2所示，與sham組比較，MCAO組p-Akt蛋白表達水平明顯降低，p-GSK-3β、p-CRMP-2蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與MCAO組比較，MCAO+Sal組p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達水平明顯升高，p-CRMP-2蛋白表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 Effects of salidroside onneurological score in MCAO rats(±s,n=6)

3.3紅景天苷對MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織NF200蛋白表達的影響激光共聚焦顯微鏡下觀察，NF200蛋白主要表達在胞膜和軸突膜上，各組大鼠缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)均可見NF200陽性細胞，sham組皮質(zhì)可見大量NF200陽性細胞，軸突較長，排列規(guī)則。與sham組相比，MCAO組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)NF200陽性表達細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，且纖維結(jié)構(gòu)紊亂，突起中斷；與MCAO組相比，MCAO+Sal組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)NF200陽性表達細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 3。

4 討論

Fig 2 Effects of salidroside on p-Akt/Akt(A), p-GSK-3β/GSK-3β(B) and p-CRMP-2/CRMP-2(C) protein in MCAO rats (±s,n=3)

Fig 3 Effect of salidroside on NF200 protein in MCAO rats by immunofluorescence staining(n=3, ×400, scale bar=50 μm)

缺血性腦卒中是指由血栓或栓塞所造成的缺血，發(fā)病率約占腦血管病的80%。盡管多年來人們不斷努力尋求缺血性腦卒中的防治方法，但其發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高的特點仍未能根本改變。引起急性缺血性腦卒中最常見的原因是頸內(nèi)或顱內(nèi)血管的突然阻塞，導(dǎo)致腦組織急性缺糖缺氧?；谀X缺血神經(jīng)損傷機制與時程變化的研究，目前損傷早期抗興奮性毒性、抗神經(jīng)炎性和抗凋亡，損傷后期促組織修復(fù)、再生是腦卒中治療的主要策略[6-7]。

研究表明[8]，在神經(jīng)元的軸突形成過程中存在著一個信號網(wǎng)絡(luò)，通過PI3K/Akt/GSK-3β/CRMP-2信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突的特性。其中，Akt蛋白是一種在腦缺氧/缺血后發(fā)揮保護作用的重要促生存激酶。Akt通過磷酸化Ser473殘基而激活，Akt激活后可使下游蛋白磷酸化，如GSK-3β、Bcl-XL/Bcl-2相關(guān)死亡促進因子(Bcl-XL/Bcl-2 associated death promoter，Bad)、半胱天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)等而抑制相關(guān)作用[9]。GSK-3β是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與糖代謝、細胞形態(tài)的形成及細胞增殖等多種細胞生物功能的調(diào)控，是Akt的下游因子，在信號通路中起著關(guān)鍵的作用。GSK-3β的Ser9殘基磷酸化后其活性被抑制，調(diào)節(jié)CRMP-2的活性，繼而促進了神經(jīng)元軸突的生長[10]。CRMP-2在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)高表達，并在軸突生長導(dǎo)向中發(fā)揮重要作用[11]。CRMP-2磷酸化狀態(tài)影響神經(jīng)元的極性，CRMP-2 Thr-514位點磷酸化水平升高，最終抑制了神經(jīng)元軸突的發(fā)生、發(fā)展和成熟[12]。

缺血在損傷修復(fù)時會刺激未受累的神經(jīng)元出芽和形成新的突觸聯(lián)系[13]，此過程中同時將伴隨一些相關(guān)蛋白的合成和表達如生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43，GAP43)、NF200等。其中NF200是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，在生理情況下對軸突運輸和維持細胞的形態(tài)中起著很大作用，NF200表達水平能很好地反映神經(jīng)軸突損傷和修復(fù)情況。因此，本研究采用NF200的免疫熒光染色作為軸突再生的評價指標(biāo)。

綜上所述，紅景天苷對局灶性腦缺血/再灌注大鼠具有神經(jīng)保護作用，其機制可能與促進Akt、GSK-3β的磷酸化，抑制CRMP-2的磷酸化，促進軸突再生，改善大鼠梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)有關(guān)。

(致謝：本課題由康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心和國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心資助，并在福建省科技廳福建省中藥學(xué)重點實驗室完成。非常感謝福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心對動物實驗的大力支持!)

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SalidrosideregulatesAkt/GSK-3β/CRMP-2expressionandaxonalregenerationinMCAOrats

ZHANG Xiao-qin, MIAO Xue-zheng, ZHOU Li-ying, XU Li-wei, LAI Wen-fang, HONG Gui-zhu
(CollegeofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

AimTo investigate the axonal regeneration effect of salidroside in MCAO rats and its potential mechanism.MethodsThirty-six healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: sham, MCAO, MCAO+Sal groups. The rats were subjected to focal cerebral ischemia/reperfusion with suture-occluded method. Neurological deficit testing was performed with Zea Longa scale. The protein expression of p-Akt(Ser473), Akt, p-GSK-3β(Ser9), GSK-3β, p-CRMP-2(Thr514) and CRMP-2 in side cerebral ischemic tissues were determined using Western blot analysis. NF200 immunofluorescence staining was used to evaluate axonal regeneration.ResultsCompared with MCAO group, salidroside significantly improved the neurological deficit, up-regulated the protein expression of NF200, p-Akt and p-GSK-3β, and inhibited the protein expression of p-CRMP-2.ConclusionsSalidroside improves neurological function recovery after focal cerebral/ischemic injury in rats, which may be associated with the up-regulation of phosphorylated Akt and GSK-3β and inhibition of phosphorylated CRMP-2, thereby promoting axonal regeneration.

salidroside; local cerebral ischemia/ reperfusion; axonal regeneration; Akt; GSK-3β; CRMP-2

時間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.050.html

2017-06-08，

2017-07-10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81473382)；福建省科技廳重點項目(No 2014Y4004)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(No 2015J01685)；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管-科研創(chuàng)新平臺專項資助項目(No X2015009-平臺)

張小琴(1986-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：582990886@qq.com； 洪桂祝(1966-)，女，博士，教授，研究方向：心腦血管藥效藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：guizhuhong@yahoo.co.uk

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.025

A

：1001-1978(2017)09-1320-05

R-332；R284.1；R322.81；R338.1；R743.310.22；R977.6