譯/劉海燕 校/顧佳升

（1 新希望乳業(yè)股份有限公司；2 上海奶業(yè)行業(yè)協(xié)會(huì)）

熱誘導(dǎo)牛奶中乳清蛋白與酪蛋白膠束反應(yīng)的機(jī)理研究

譯/劉海燕1校/顧佳升2

（1 新希望乳業(yè)股份有限公司；2 上海奶業(yè)行業(yè)協(xié)會(huì)）

將牛奶加熱到90 ℃，然后采用具體界定反應(yīng)的最終產(chǎn)物的方法來研究在熱誘導(dǎo)條件下，乳清蛋白和酪蛋白膠束之間的相互作用機(jī)理。在脫脂乳里添加了不同數(shù)量的乳清蛋白，加熱后分別查驗(yàn)脫脂乳和依然懸浮分散在其中的酪蛋白膠束，由此獲得了牛奶在熱誘導(dǎo)條件下，“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互之間作用機(jī)制的確切信息。以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與κ-酪蛋白的比率，以及在酪蛋白膠束顆粒中發(fā)現(xiàn)的α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的比率，作為評(píng)估牛奶中發(fā)生熱誘導(dǎo)反應(yīng)程度的指標(biāo)物。結(jié)果顯示，在低溫（70～90 ℃）間歇式加熱條件下，各種乳清蛋白相互作用，形成多類可溶性的復(fù)合物，在熱誘導(dǎo)過程中，擔(dān)任了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進(jìn)一步與酪蛋白膠束發(fā)生反應(yīng)的中間體角色。對(duì)于乳清蛋白與酪蛋白膠束之間發(fā)生的任何交聯(lián)反應(yīng)而言，β-乳球蛋白的存在都是必需的；此外還發(fā)現(xiàn)，加熱后出現(xiàn)在酪蛋白膠束顆粒中β-乳球蛋白的數(shù)量，似乎受到酪蛋白膠束表面結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的限制，而這些結(jié)合位點(diǎn)的分布是離散的。

熱誘導(dǎo)牛奶；乳清蛋白；酪蛋白；機(jī)理

在熱處理過程中，牛奶發(fā)生著各種反應(yīng)，包括乳清蛋白的變性和聚集，以及乳清蛋白與酪蛋白膠束和脂肪球之間多種復(fù)合物的形成。關(guān)于α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的變性現(xiàn)象，目前已經(jīng)通過多種模擬系統(tǒng)有了廣泛的研究。然而，即使理解了單個(gè)蛋白質(zhì)的變性機(jī)理，也只是對(duì)牛奶的熱處理期間所發(fā)生的復(fù)雜系列反應(yīng)的初始階段情況有初步的了解?；谶@個(gè)原因，目前需要一個(gè)不同的方法，旨在確定中間體的形成，以及環(huán)境條件的變化對(duì)它們的影響效果，即在加熱過程中“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”是如何相互作用的。

當(dāng)全脂奶被加熱后，乳清蛋白不僅與酪蛋白膠束相互作用，而且與脂肪球相互作用。最近的研究已經(jīng)證明，雖然乳清蛋白與乳脂肪球結(jié)合的速度很快但數(shù)量較少，如果與結(jié)合于酪蛋白膠束上的數(shù)量相比較，在乳清蛋白和酪蛋白膠束之間形成的復(fù)合物，是迄今為止熱誘導(dǎo)反應(yīng)的重要的中間產(chǎn)物，并且存在于β-Lg（β-乳球蛋白）天然結(jié)構(gòu)中的游離巰基，似乎在相互作用過程中發(fā)揮了重要的作用。在牛奶熱處理過程中形成的主要復(fù)合物是“β-Lg/κ-酪蛋白復(fù)合物”。研究發(fā)現(xiàn)，不僅β-Lg，α-La也參與了與酪蛋白膠束的反應(yīng)。已有報(bào)道，當(dāng)存在β-Lg時(shí)，α-La的變性程度會(huì)增加。也有報(bào)道指出，α-La的自身變性其實(shí)是半可逆的。

盡管對(duì)牛奶的熱處理已經(jīng)有了廣泛的研究，但是目前關(guān)于在熱誘導(dǎo)下，α-La和β-Lg與酪蛋白膠束之間的相互作用機(jī)制細(xì)節(jié)并不清楚。本文描述了在牛奶溫度高達(dá)90℃的加熱過程中，就添加乳清蛋白到脫脂乳中的效果，以及對(duì)依然懸浮分散的酪蛋白膠束的影響，探討α-La、β-Lg和酪蛋白膠束顆粒之間的相互作用問題。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從圭爾夫大學(xué)的Elora研究站收集新鮮的全脂牛奶。在加入0.2 g/L的疊氮化鈉作為防腐劑后，通過低速離心（3 000 g，20 min）將牛奶脫脂。再通過離子交換層析制備單個(gè)α-La和β-Lg，用4 L 20 mmol/L的Tris pH值緩沖液（0～1 M NaCl梯度）洗脫。透析后，將分離的蛋白質(zhì)凍干并在加熱前以干粉形式加入到脫脂乳中。在熱處理之前，將純化的α-La和β-Lg加入到脫脂乳中，在改變了原奶蛋白質(zhì)濃度的情況下，研究α-La、β-Lg和酪蛋白膠束之間的熱誘導(dǎo)復(fù)合物的組成所產(chǎn)生的影響。此外，還采用超濾牛奶的方法處理懸浮的酪蛋白膠束。將未處理過的脫脂乳用60 000 g離心40 min的方法，獲得凈化的酪蛋白膠束。使用10 000 Da截留膜的實(shí)驗(yàn)室超濾裝置制備超濾液。在熱處理之前加入并分散了不同數(shù)量的純化α-La和β-Lg。

將樣品在溫控水?。?0～90℃）的試管中加熱不同時(shí)間。熱處理后，樣品在冰浴中快速冷卻。

采用超速離心方法，從熱處理過的樣品中分離獲得在熱誘導(dǎo)下乳清蛋白和酪蛋白膠束之間相互作用所形成的最終復(fù)合物，采用Corredig和Dalgleish在1996年所述的SDS-PAGE電泳法進(jìn)行分析，根據(jù)α-La和β-Lg與κ-酪蛋白相結(jié)合比率進(jìn)行定量，將這些比率關(guān)系作為乳清蛋白和酪蛋白之間的反應(yīng)指數(shù)。此外，有報(bào)道建議使用α-La/β-Lg作為一種評(píng)估脫脂乳經(jīng)受熱處理強(qiáng)度的方法，用以研究α-La / β-Lg與乳中蛋白質(zhì)濃度比率的變化規(guī)律。

2 結(jié)果和討論

當(dāng)牛奶經(jīng)過75～90 ℃的間歇加熱處理時(shí)，乳清蛋白與酪蛋白膠束的相互作用程度隨時(shí)間和溫度的增加而加劇。通常與膠束顆粒相結(jié)合的乳清蛋白數(shù)量，隨著加熱時(shí)間的延長而增加至最大值，并且溫度越高，蛋白質(zhì)之間的相互作用越快。早前的研究表明，環(huán)境條件的變化強(qiáng)烈影響α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的熱誘導(dǎo)相互作用。方差分析顯示，不僅加熱的時(shí)間和溫度，而且脫脂乳中存在的乳清蛋白數(shù)量，都將顯著影響與酪蛋白膠束相結(jié)合的α-La/κ-酪蛋白和β-Lg/ κ-酪蛋白的數(shù)量。

熱處理后觀察到的α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合情況，與Law等在1994年研究結(jié)果相一致。圖1為加熱溫度為80 ℃，保持不同時(shí)間的脫脂乳，與酪蛋白結(jié)合的重量比率變化情況，采用4 次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果的平均值，計(jì)算黑塊、左坐標(biāo)為α-La/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓、右坐標(biāo)為β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率。結(jié)果顯示，在低于90 ℃的加熱過程中，蛋白質(zhì)不僅與膠束相互作用，而且具有非常相似的動(dòng)力學(xué)行為（圖1）。

溫度（90 ℃）似乎在反應(yīng)機(jī)制中是一個(gè)關(guān)鍵臨界值，與表達(dá)乳清蛋白變性動(dòng)力學(xué)的阿倫尼烏斯圖斜率變化一致。當(dāng)牛奶在低溫下加熱時(shí)，兩種乳清蛋白質(zhì)的變化情況表現(xiàn)相似，其在酪蛋白膠束顆粒中的數(shù)量，與它們在原奶中的濃度直接相關(guān)。圖2為加熱溫度為80 ℃的脫脂乳，隨著保持時(shí)間的增加，與酪蛋白結(jié)合的乳清蛋白/κ-酪蛋白的重量比率也在變化，黑塊所示2 g/L β-Lg脫脂乳中β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓所示2 g/L α-La脫脂乳中α-La/κ-酪蛋白的重量比率。顯示結(jié)果也證實(shí)了上述假設(shè)。

圖1 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨著保持時(shí)間的變化與酪蛋白結(jié)合的重量比率變化情況

圖2 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨保持時(shí)間的變化，與酪蛋白結(jié)合的乳清蛋白/κ-酪蛋白比率的變化情況

當(dāng)添加2 g/L α-La中時(shí)，α-La和β-Lg的濃度相當(dāng)，具有相同的相互作用動(dòng)力學(xué)，處理后與膠束顆粒相結(jié)合的數(shù)量也相似。加入2 g/L β-Lg的脫脂乳在80 ℃加熱（圖2），幾分鐘后即達(dá)到β-Lg /κ-酪蛋白的最大值。而β-Lg /κ-酪蛋白所達(dá)到的高數(shù)值，與對(duì)照奶樣品所達(dá)到的穩(wěn)定值并沒有顯著的不同。該結(jié)果表明，在酪蛋白膠束顆粒的表面上只有一定數(shù)量的位點(diǎn)可以用于與β-乳球蛋白發(fā)生相互作用。α-La的作用行為不同于β-Lg，在相同條件下加熱后，α-La即可以增加與酪蛋白膠束顆粒相結(jié)合的數(shù)量。

加熱后膠束顆粒中兩種乳清蛋白的存在及其在低溫（直到90℃）下加熱時(shí)的類似動(dòng)力學(xué)行為表明，乳清蛋白內(nèi)部可能形成了可溶性的聚合物，即兩種乳清蛋白——α-La和β-Lg，彼此反應(yīng)，形成中間體復(fù)合物，再與酪蛋白膠束發(fā)生相互作用?，F(xiàn)已知在低溫下，β-Lg需要時(shí)間改變結(jié)構(gòu)，可能是α-La參與酪蛋白膠束反應(yīng)的原因。在加熱下依然懸浮分散的酪蛋白膠束，添加不同數(shù)量的α-La和β-Lg，結(jié)果表明盡管α-La的存在并不影響β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合作用，但β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合需要 α-La。

圖3顯示80 ℃加熱后在酪蛋白膠束顆粒中α-La/β-Lg的比率，與脫脂乳中α-La和β-Lg濃度的函數(shù)關(guān)系。添加不同數(shù)量乳清蛋白的脫脂乳，在同為80 ℃但不同保持時(shí)間條件下，與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La/β-Lg的比率，三者之間的函數(shù)關(guān)系，其中黑圓為對(duì)照樣脫脂乳，黑塊為添加2 g/L α-La的脫脂乳，白圓為添加2 g/L β-Lg的脫脂乳，白塊為各添加1 g/L α-La和β-Lg的脫脂乳。

對(duì)沒有添加蛋白質(zhì)的脫脂乳進(jìn)行的加熱試驗(yàn)中，α-La/ β-Lg的比率反映了它們的原始組成。當(dāng)添加2 g/L α-La時(shí)，兩種乳清蛋白具有相似的濃度，與酪蛋白膠束相結(jié)合的α-La/ β-Lg的比率高于對(duì)照樣品中的比率，并且達(dá)到約0.8 mg α-La/ mg β-Lg。當(dāng)1 g/L α-La和1 g/ L β-Lg同時(shí)添加到脫脂乳中時(shí)，α-La/β-Lg的比率雖然與對(duì)照樣品相比是明顯不同的，然而向脫脂乳中加入更多的α-La時(shí)，再也沒有顯著的效果差異了（圖3）。該結(jié)果證實(shí)了如下假設(shè)，即只存在數(shù)量有限的離散分布的結(jié)合位點(diǎn)可用于β-Lg與酪蛋白膠束的相互結(jié)合。此外，額外添加β-Lg到脫脂乳中，如果與對(duì)照樣品比較，并不能有意義地改變與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La和β-Lg的比率。筆者對(duì)依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束，再加入不同量的乳清蛋白進(jìn)行了多次研究，得到了上述結(jié)論。

圖3 不同數(shù)量乳清蛋白脫脂乳，在不同保持時(shí)間下，與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La/β-Lg比率之間的函數(shù)關(guān)系

總之，在加熱（低溫間歇加熱）條件下，認(rèn)識(shí)到了兩種主要的相互作用：一是β-Lg與酪蛋白膠束通過κ-酪蛋白結(jié)合的直接相互作用；二是α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合，是通過在溶液中這兩種乳清蛋白之間的反應(yīng)所形成的中間體來實(shí)現(xiàn)的。對(duì)脫脂乳和依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束兩種物料所進(jìn)行的熱處理試驗(yàn)，都表明了能夠與酪蛋白膠束相互結(jié)合的β-Lg數(shù)量，受可用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的限制。能夠與酪蛋白膠束顆粒相結(jié)合的α-La的數(shù)量，似乎只取決于其在奶中的濃度。C

英文原文：Corredig M，Dalgleis D G. The mechanisms of the heat-induced interaction of whey proteins with casein micelles in milk[J]. International Dairy Journal，1999，9 （3–6）：233-236.

2017-06-19）

劉海燕，博士，高級(jí)工程師，從事乳制品生產(chǎn)管理、質(zhì)量控制、乳品技術(shù)研究工作。

校者簡介：

顧佳升（1948-），男，學(xué)士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槿槠芳庸ぜ皺z驗(yàn)。