白麗麗++++++戴華++++++程莎++++++孔杜林

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）同時測定海南糞箕篤中小檗堿和千金藤素含量的方法。 方法 色譜柱Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.0 mm×50 mm，4 μm）；流動相為水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱溫40℃，流速為0.35 mL/min，梯度洗脫。采用電噴霧正離子模式電離，選擇多重反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。 結(jié)果 小檗堿和千金藤素在5.0～1000.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)> 0.98；小檗堿的平均回收率為101.46%～104.76%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.14%；千金藤素的平均回收率為95.96%～104.39%，RSD為4.63%；測得文昌、興隆兩地糞箕篤中小檗堿和千金藤素分別為0.889、1.07 μg/g和7.62、38.0 μg/g。 結(jié)論 HPLC-MS/MS具有簡單、分析速率快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于糞箕篤及千金藤屬植物中生物堿的定量分析。

[關(guān)鍵詞] 糞箕篤；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；生物堿；含量測定

[中圖分類號] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0145-03

[Abstract] Objective To establish a method for the simultaneous determination of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods The separation of the analytes were carried out on a Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A column （2.0 mm×50 mm， 4 μm） using methanol containing 0.1‰ formic acid as mobile phase， the column temperature was 40℃， flow rate was 0.35 mL/min， gradient elution. HPLC-MS/MS was performed in multiple reaction monitoring mode via positive electrospray ionization （ESI+）. Results The calibration curves showed good linearity over the tested range from 5.0 to 1000.0 ng/mL for 2 compounds （the correlation coefficients> 0.98）.The recoveries and the relative standard deviations of berberin and cepharanthine was 101.46%-104.76%， 2.14% and 95.96%-104.39%， 4.63% respectively. The content of berberin and cepharanthine in Stephania longa L. from Wenchang， Xinglong 2 areas were 0.889， 1.07 μg/g and 7.62， 38.0 μg/g. Conclusion The method is simple， fast and highly sensitivity， which can be used to control the quality of alkaloids from Stephania longa L..

[Key words] Stephania longa L.； HPLC-MS/MS； Alkaloids； Content determination

糞箕篤（Stephania longa L.）為防己科千金藤屬植物，多年生草質(zhì)藤本。在我國福建、廣東、海南等地區(qū)有廣泛分布，是天然的南藥資源[1]。具有清熱解毒、消腫利濕、袪風(fēng)活絡(luò)、抑菌、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等功效[2-7]。該屬藥用植物繁多，富含生物堿，主要有可撲堿型、阿撲堿類，原小檗堿類，蓮花烷類生物堿、雙芐基異喹啉類、嗎啡二烯酮型等。有關(guān)糞箕篤中生物堿的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及化學(xué)合成均有報道[8-12]，生物堿含量測定的方法很多[13-18]，但采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對糞箕篤生物堿進(jìn)行定性定量分析尚未有報道。為尋找千金藤屬植物中有用的生物堿資源，本文通過對海南文昌、興隆糞箕篤根莖中的兩種生物堿進(jìn)行含量測定，建立HPLC-MS/MS定性定量分析方法，為糞箕篤及其千金藤屬植物的開發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器：API4000+串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀（AB Sciex公司，美國），通過Turbo V離子源接口與島津公司Prominence UFLC液相色譜儀串聯(lián)。AB-SCIEX軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理；液質(zhì)聯(lián)用儀LC-MS專用氮?dú)獍l(fā)生器（NitroFlowLab，美國）；離心機(jī)（Sigma，德國）；分析天平（北京賽多利斯公司）；超純水器（Millipore公司）；紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

小檗堿（批號110713-201613）和千金藤素（批號111647-200301）對照品（中國食品藥品檢定研究所）；甲醇（HPLC級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈為優(yōu)級純（Tedia，美國）；其他藥品均為分析純，水為超純水。

糞箕篤采自海南文昌、興隆，由海南醫(yī)學(xué)院曾念開教授鑒定為防己科（Menispermaceae）千金藤屬（Stephania）糞箕篤，陰干，粉碎成細(xì)粉備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取適量小檗堿和千金藤素于容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度配制成1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱中儲存。

2.2 供試品溶液及樣品的制備

精密稱定恒溫干燥的糞箕篤粉末2 g（精確至0.0001 g），置于圓底燒瓶中，用85%乙醇回流2 h，過濾，于200 mL容量瓶中定容至刻度，于4℃冰箱中儲存、備用。

將供試品溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，5000 r/min離心5 min，吸取5.0 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，制成樣品等待分析。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

色譜條件：色譜柱為Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A（2.00 mm×50 mm，4 μm）；流動相為水（0.1‰甲酸，A相）-甲醇（0.1‰甲酸，B相）；柱溫40℃，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣體積5.0 μL梯度洗脫：0～1 min為0% B，1～1.01 min B相從0%迅速增加到30%，1.01～10 min B相從30%緩緩增加到100%，10～10.01 min從100%回到0%，10.01～15 min維持在0% B進(jìn)行平衡。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）正離子模式（+），噴霧電壓5.5 kV，噴霧溫度550℃，簾氣為25psi，GAS1為40psi、GAS2為60psi，CAD為6；多反應(yīng)檢測掃描（MRM）模式對小檗堿、千金藤素進(jìn)行掃描，每個離子對的掃描時間為10 ms。小檗堿和千金藤素檢測離子對分別為337.10→321.10和607.3→365.1。兩種生物堿的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

2.4 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確移取小檗堿（1.0 μg/mL）、千金藤素（1.0 μg/mL）的對照品溶液并依次配成5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 ng/mL對照品溶液，分別注入液-質(zhì)色譜儀，記錄峰面積。分別以質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，小檗堿回歸方程為：Y=6.91×103X+1.27×104（r=0.9993），千金藤素回歸方程為：Y=5.96×102X+3.6×103（r=0.9898）。結(jié)果表明小檗堿和千金藤素均在5.0～1000.0 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取興隆采摘的糞箕篤粉末2.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法提取，制成樣品溶液。按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣5 μL，測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積。小檗堿的RSD為1.90%，千金藤的RSD為2.61%。表明重復(fù)性良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 把制好的樣品溶液及100.0 ng/mL的對照品溶液置于4℃冰箱中儲存，分別于0、4、8、12、16、24 h后，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣5 μL，測定。對照品小檗堿、千金藤素的RSD分別為2.25%、2.32%，樣品溶液小檗堿、千金藤素的RSD分別為2.12%、1.89%。結(jié)果表明，與0 h相比較，24 h后峰面積基本保持不變。結(jié)果表明對照品及供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5.3 精密度和回收率 采用空白樣品加標(biāo)的方法進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，在空白樣品中添加低、中、高3個水平的標(biāo)樣后（10.0、100.0、500.0 ng/mL），每個添加量平行測定6次，計算回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明小檗堿的平均回收率為101.46%～104.76%，RSD為2.14%；千金藤素的平均回收率95.96%～104.39%，RSD為4.63%，結(jié)果表明該方法回收率穩(wěn)定，可滿足實(shí)際樣品的檢測要求。小檗堿和千金藤素對照品質(zhì)譜圖如圖1所示：其中縱坐標(biāo)表示響應(yīng)強(qiáng)度（cps），橫坐標(biāo)表示保留時間（min）。從圖1可知，小檗堿對照品和千金藤素對照品分別在3.22、3.01 min處出峰。

2.6 實(shí)際樣品的測定

文昌和興隆兩地采摘的糞箕篤根莖經(jīng)陰干、粉碎成40目細(xì)粉。分別精確稱取2.0 g粉末經(jīng)回流、過濾后按“2.2”項(xiàng)下方法處理成樣品，定容至100 mL，經(jīng)紫外分光光度法測得其總生物堿含量平均為0.40%[10]。樣品經(jīng)質(zhì)譜分析如圖1所示：文昌和興隆糞箕篤中小檗堿、千金藤素分別在3.21、3.19；2.98、2.99 min處出峰，峰形尖銳。測得文昌、興隆兩地小檗堿含量分別為0.889、1.07 μg/g，千金藤素含量分別為7.62、38.0 μg/g，分別占總堿含量的0.022%、0.027%和0.19%、0.95%。

3 討論

由于提取方式的不同，所得總生物堿也有所不同；同一藥材不同產(chǎn)地的各種生物堿的種類及含量亦有一定的差異[19-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海南兩地糞箕篤中小檗堿和千金藤素含量有明顯差異，千金藤素含量遠(yuǎn)高于小檗堿，但小檗堿地區(qū)間含量差異不是十分明顯。本方法采用梯度洗脫，分別考察了水-甲醇、水-乙腈、水-甲醇（1‰甲酸）及水-乙腈（1‰甲酸）作為流動相，發(fā)現(xiàn)在不含酸的體系中小檗堿、千金藤素有拖尾現(xiàn)象；而水-乙腈（1‰甲酸）作為流動相，基線不是很穩(wěn)定，分離效果不如水-甲醇（1‰甲酸）效果好。因此，本研究采用水-甲醇（1‰甲酸）為流動相。使用的UFLC液相色譜儀配Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A型色譜柱，與文獻(xiàn)[15-16]報道HPLC比較，具有用時少、出峰快速、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)。本研究僅對海南當(dāng)?shù)厮幉倪M(jìn)行上述相關(guān)考察，其他不同地區(qū)及植物不同部位的質(zhì)量考察還有待進(jìn)一步研究。

總之，本試驗(yàn)建立的HPLC-MS/MS方法具有分析速率快、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于糞箕篤及千金藤屬植物中生物堿的定量分析。

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