曾 薇，朱金峰，單 莉*

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1.肺內(nèi)科一病區(qū)；2.胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011）

·實驗研究·

miR-133b介導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的失巢凋亡

曾 薇1，朱金峰2，單 莉1*

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院1.肺內(nèi)科一病區(qū)；2.胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011）

目的 研究探討miR-133b在人食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡中的作用。方法 人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimic，細(xì)胞凋亡實驗檢測上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimic對細(xì)胞失巢凋亡的影響。結(jié)果 人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450轉(zhuǎn)染miR-133b mimic，可顯著上調(diào)細(xì)胞中miR-133b在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞失巢凋亡的發(fā)生。結(jié)論 人食管鱗癌細(xì)胞中過表達(dá)的miR-133b可以降低細(xì)胞失巢凋亡抵抗。

食管鱗癌；miR-133b；失巢凋亡

轉(zhuǎn)移是食管鱗癌等大多數(shù)實體腫瘤引發(fā)死亡的首要原因，防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散是提高食管鱗癌患者生存率的一項重要手段目前研究發(fā)現(xiàn)，失巢凋亡（Anoikis）與腫瘤的轉(zhuǎn)移和存活過程密切相關(guān)。失巢凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡，當(dāng)細(xì)胞與鄰近細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生接觸脫離時，通過線粒體或細(xì)胞表面死亡受體途徑而誘導(dǎo)發(fā)生的[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與腫瘤的失巢凋亡過程相關(guān)[2-3]。miRNAs是一類長度為18～25 nt的調(diào)控性的非編碼單鏈小分子RNA[4]，通過抑制靶mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA降解，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。Kano等研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織中miR-133b的表達(dá)下調(diào)，提示miR-133b可能作為抑癌基因，參與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程。Fu等研究報道，在食管鱗癌組織中呈低表達(dá)的miR-133b與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度呈負(fù)相關(guān)，并預(yù)測miR-133b可作為食管鱗癌治療的潛在靶點。但是，目前對于miR-133b在食管鱗癌失巢凋亡的作用尚不完全清楚，本文將對此進(jìn)行初步的研究、探討。

1 材料與方法

1.1 材料

①細(xì)胞：人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450均購自ATCC細(xì)胞庫。②試劑：DMEM培養(yǎng)基、FBS、PBS、Trypsin Solution（美國Gibco公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國ThermoFisher Scientific公司），miR-133bmimic、scramble（購自美國Life Technologie公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450置于含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的90%DMEM和10%胎牛血清中，在5% CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，隔日更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)90%匯合時，用0.25%胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450并計數(shù)，細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞融合至50%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；使用250 μl無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋4.0 μg質(zhì)粒；使用250 μl DMEM培養(yǎng)基稀釋10 μl Lipofectamine 2000試劑；混合稀釋的質(zhì)粒與稀釋的Lipofectamine 2000，在室溫下孵育20 min；加入混合物，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻；在37℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.3 miR-133b的表達(dá)檢測

查找目的基因序列，設(shè)計引物（見表1）；Trizol法提取細(xì)胞的總RNA；甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的完整性；紫外分光光度計測定RNA的含量（A260值）和純度（A260/A280比值）；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，進(jìn)行定量PCR；擴(kuò)增結(jié)束后分析溶解曲線；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性；每個樣本中miRNA含量是指它與同標(biāo)本中U6 snRNA的相對量，依據(jù)公式2-ΔCt計算得到。

表1 qRT-PCR實驗引物序列

1.2.4 失巢凋亡的誘導(dǎo)

PolyHEMA以終濃度為20 mg/ml溶于95%的乙醇，65℃水浴至溶解；按lml孔鋪好六孔板，晾干備用；將消化好的細(xì)胞置于鋪有PolyHEMA的六孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，以模擬細(xì)胞脫離鄰近細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡。

1.2.5 細(xì)胞失巢凋亡檢測

人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450轉(zhuǎn)染miR-133b mimic、scramble 24 h后繼續(xù)懸浮培養(yǎng)18 h；用不含EDTA的胰酶消化收集上述各組細(xì)胞；使用預(yù)冷1×PBS洗滌細(xì)胞；使用1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入Annexin V-FITC，避光室溫孵育15 min；上機(jī)前進(jìn)行PI標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，各組間均數(shù)比較采用t檢驗或方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人食管鱗癌細(xì)胞中miR-133b的表達(dá)

人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450分別轉(zhuǎn)染miR-133b mimic、scramble作為實驗組和對照組。人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150，實驗組中miR-133b mRNA相對表達(dá)量為1.77±0.07，對照組為0.86±0.06，兩組比較P＜0.01，見表2。人食管鱗癌細(xì)胞KYSE450，實驗組中miR-133b mRNA相對表達(dá)量為1.77±0.05，對照組為0.83±0.05，兩組比較P＜0.01，見表2、表3。

表2 miR-133b在人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150中的表達(dá)（±s）

表2 miR-133b在人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150中的表達(dá)（±s）

2-ΔΔCT t P實驗組 1.77±0.07 16.71 ＜0.01對照組 0.86±0.06

表3 miR-133b在人食管鱗癌細(xì)胞KYSE450中的表達(dá)（±s）

表3 miR-133b在人食管鱗癌細(xì)胞KYSE450中的表達(dá)（±s）

分組 2-ΔΔCTt P實驗組 1.77±0.05 23.50 ＜0.01對照組 0.83±0.05

2.2 miR-133b促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡

人食管鱗癌細(xì)胞KYSE150、KYSE450轉(zhuǎn)染miR-133b mimic、scramble 24 h后繼續(xù)懸浮培養(yǎng)18 h，采用Annexin/PI雙染法對細(xì)胞失巢凋亡進(jìn)行檢測。scramble/KYSE150懸浮組細(xì)胞失巢凋亡率為51.00±3.61，miR-133b mimic/KYSE150懸浮組細(xì)胞失巢凋亡率為61.67±1.53，兩組比較P＜0.01； scramble/KYSE450懸浮組細(xì)胞失巢凋亡率為50.67±3.21，miR-133b mimic/KYSE450懸浮組細(xì)胞失巢凋亡率為63.33±6.03，兩組比較P＜0.05；結(jié)果表明，上調(diào)miR-133b的表達(dá)能明顯促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡的發(fā)生，見表4。

表4 miR-133b促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞凋亡（±s）

表4 miR-133b促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞凋亡（±s）

注：a：scramble/KYSE150懸浮組vs miR-133b mimic/KYSE150懸浮組；b：scramble/KYSE450懸浮組 vs miR-133b mimic/KYSE450懸浮組

細(xì)胞凋亡比率（%） t P scramble/KYSE150懸浮組 51.00±3.61 miR-133b mimic/KYSE150懸浮組 61.67±1.53 4.72 ＜0.01ascramble/KYSE450懸浮組 50.67±3.21 miR-133b mimic/KYSE450懸浮組 63.33±6.03 3.21 ＜0.05b

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，進(jìn)入血液循環(huán)中并得以存活，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs），到達(dá)遠(yuǎn)處器官并不斷增殖，最終形成轉(zhuǎn)移灶。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶侵襲入血循環(huán)后產(chǎn)生抵抗失巢凋亡是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。失巢凋亡是指細(xì)胞脫離原來的生長部位，失去細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，從而發(fā)生的一種程序化死亡。正常細(xì)胞和大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在脫離原發(fā)灶之后，由于喪失了周圍細(xì)胞黏附和賴以生存的細(xì)胞基質(zhì)都會發(fā)生失巢凋亡。然而，部分腫瘤細(xì)胞在脫離原發(fā)灶進(jìn)入血液循環(huán)后，可以通過多種途徑獲得抵抗失巢凋亡的能力，腫瘤細(xì)胞才有機(jī)會與血管內(nèi)皮進(jìn)行黏附，從血管壁滲出并進(jìn)入周圍基質(zhì)，最終在新的環(huán)境下形成轉(zhuǎn)移灶。因此，對腫瘤細(xì)胞抗失巢調(diào)往的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究，對于了解腫瘤轉(zhuǎn)移過程至關(guān)重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染scramble相比，人食管鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133b mimics可以顯著上調(diào)miR-133b在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。接著，我們通過在鋪有PolyHEMA的六孔板中對細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，來模擬食管鱗癌細(xì)胞與鄰近細(xì)胞脫離的狀態(tài)，誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡，并采用Annexin/PI雙染法對細(xì)胞的失巢凋亡進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染scramble相比，轉(zhuǎn)染miR-133b mimic上調(diào)miR-133b的表達(dá)，可顯著提高食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡的比率。提示在食管鱗癌中，過表達(dá)的miR-133b可以促進(jìn)脫離鄰近細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡，減少食管鱗癌細(xì)胞的失巢凋亡抵抗，對腫瘤的轉(zhuǎn)移起到負(fù)向調(diào)控的作用，提示miR-133b可能作為今后食管鱗癌的診療靶點之一。

[1] Grossmann J.Molecular mechanisms of detachmentinduced apoptosis—Anoikis[J].Apoptosis,2002,7(3):247-260.

[2] Liu Y,Zhang Y,Wu H,et al.miR-10a suppresses colorectal cancer metastasis by modulating the epithelial-to-mesenchymal transition and anoikis[J].Cell Death Dis,2017,8(4):e2739.

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本文編輯：吳 衛(wèi)

R735.1

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ISSN.2095-8242.2017.30.5743.02

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單莉，E-mail：shanlinew319@163.com