康世宗，張海臣，吳永輝，谷克仁，

(1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，鄭州 450001； 2.吉林工程職業(yè)學(xué)院,吉林 四平 136001; 3.廣州倚德生物科技有限公司，廣州 511340)

綜合利用

L-α-甘油磷脂酰膽堿的制備、純化及檢測研究進(jìn)展

康世宗1，張海臣2，吳永輝3，谷克仁1，2

(1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，鄭州 450001； 2.吉林工程職業(yè)學(xué)院,吉林 四平 136001; 3.廣州倚德生物科技有限公司，廣州 511340)

L-α-甘油磷脂酰膽堿(L-α-GPC) 是動(dòng)物體內(nèi)天然存在的水溶性磷脂代謝產(chǎn)物，是乙酰膽堿合成的膽堿源。甘油磷脂酰膽堿能夠有效增強(qiáng)人體的記憶力和認(rèn)知能力，預(yù)防和治療多種疾病。然而國內(nèi)L-α-GPC的制備、純化和檢測技術(shù)相對不夠成熟，較難滿足市場對高質(zhì)量、高純度L-α-GPC的需求。通過對國內(nèi)外L-α-GPC的制備、純化及檢測方法進(jìn)行綜述，進(jìn)一步為甘油磷脂酰膽堿以及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)提供支持。

L-α-甘油磷脂酰膽堿；制備；純化；檢測

L-α-甘油磷脂酰膽堿(L-α-GPC)又稱甘油磷酸膽堿、甘磷酸膽堿，是動(dòng)物體內(nèi)天然存在的水溶性磷脂代謝產(chǎn)物，經(jīng)口服后，能到達(dá)膽堿突觸末梢并增加乙酰膽堿的合成和釋放[1-2]。L-α-GPC不僅可以作為保健品，促進(jìn)大腦中乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的生物合成，提高人的記憶能力和認(rèn)知能力，也能有效治療老年癡呆類疾病如阿爾茨海默病，被醫(yī)藥界稱為“大腦的防衰老營養(yǎng)素”[3-4]。L-α-GPC還可以保護(hù)肝臟，抵抗高脂蛋白的脂肪滲透，起到抗類風(fēng)濕、抗高血脂和抗動(dòng)脈硬化的作用。另外L-α-GPC在一定程度上能夠增強(qiáng)人體肌肉力量，提高反應(yīng)敏捷度[5]。

國外對L-α-GPC的研究始于20世紀(jì)三四十年代，國內(nèi)對該產(chǎn)品的研究起步較晚，在質(zhì)量、規(guī)模方面與國外產(chǎn)品相比均存在一定的差距。純度較低的L-α-GPC中可能含有部分色素和非極性雜質(zhì)，常溫常壓下性質(zhì)不穩(wěn)定，不僅藥理作用弱，還有可能產(chǎn)生對人體有害的毒素[6-7]。國內(nèi)藥用L-α-GPC幾乎全部依靠進(jìn)口，95%以上的高純度L-α-GPC價(jià)格非常昂貴[8-9]。因此，研究和開發(fā)高純度L-α-GPC的生產(chǎn)工藝，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以滿足市場對L-α-GPC的需求，具有重要意義。

1 L-α-GPC的制備方法

由于天然存在的L-α-GPC極少，直接從牛乳或者胰臟中提取比較困難，目前國內(nèi)外制備L-α-GPC方法主要有化學(xué)醇(水)解法、非水相酶法、低沸點(diǎn)有機(jī)胺催化法和化學(xué)合成法[10]，整體上可總結(jié)為催化水解法和化學(xué)合成法。

1.1 催化水解法

目前，磷脂酰膽堿(PC)催化水解的方法有非水相或水相中用生物酶、金屬鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、有機(jī)胺等催化醇解。磷脂酰膽堿上兩個(gè)脂肪?；?見圖1中虛線標(biāo)注部分)被水解，斷開1、2位上的酯鍵就可以得到甘油磷脂酰膽堿。甘油磷脂酰膽堿含有一個(gè)季銨鹽正電荷和一個(gè)磷酸負(fù)電荷，其分子結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖1 磷脂酰膽堿分子式

圖2 L-α-GPC結(jié)構(gòu)式

阮朝濱等[11]利用堿金屬醇鹽作為催化劑，產(chǎn)品為白色固體L-α-GPC結(jié)晶，收率達(dá)到72.2%。劉磊[12]以堿金屬硅酸鹽固體堿作為催化劑，在最佳反應(yīng)條件下使大豆磷脂酰膽堿和甲醇發(fā)生酯交換反應(yīng)制備L-α-GPC，收率達(dá)到95.1%。Li等[13-15]探索了丙胺、叔丁胺作為催化劑，磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化率均可達(dá)到98%以上；并對以氫氧化四丁基銨為催化劑的反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型，提出該反應(yīng)可視為準(zhǔn)一級反應(yīng)，反應(yīng)活化能為21.98 kJ/mol[16]。

相比其他催化劑，生物酶技術(shù)作為一種安全、綠色、高效的催化技術(shù)為L-α-GPC的工業(yè)化生產(chǎn)開辟一條全新的道路。磷脂酶A1(PLA1)是一類催化磷脂sn-1位?；呋獾拿缸錥17]。其作用機(jī)理為：第一步，PC的sn-1位的脂肪酸?；凰猓蓅n-2-溶血磷脂酰膽堿(sn-2-LPC)；第二步，經(jīng)過自動(dòng)?；D(zhuǎn)移，sn-2-LPC轉(zhuǎn)化為sn-1-LPC；第三步，磷脂酶A1再作用于sn-1-LPC中sn-1 的脂肪酸酰基得到L-α-GPC。

利用以上原理，Chang等[18]以磷脂酶A1催化水解大豆磷脂酰膽堿，抑制了第二步的?；D(zhuǎn)移，得到純度為83.7%的溶血磷脂酰膽堿(LPC)，并且產(chǎn)物中沒有檢測到L-α-GPC。El等[19]利用紫外分光法連續(xù)準(zhǔn)確地測定磷脂酶A1、A2的作用位點(diǎn)和催化機(jī)理，并介紹了抑制酰基轉(zhuǎn)移的方法。Bang等[20]以大豆磷脂酰膽堿為原料，在正己烷-水(體積比5.8∶1)雙相體系中利用磷脂酶A1水解制備L-α-GPC，優(yōu)化了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、載酶量等工藝參數(shù)，然后利用乙醚萃取與硅膠柱色譜純化后得到了99.3%的高純度L-α-GPC，該研究表明相對于單水相的酶催化體系，正己烷-水雙相體系中L-α-GPC產(chǎn)率更高?？梢娙軇┑牟煌蚪缑娴氖杷再|(zhì)有所差異，水解產(chǎn)物的產(chǎn)率也不同。

常規(guī)的單一酶解法制備L-α-GPC用磷脂酶A1作催化，進(jìn)行?；淖詣?dòng)轉(zhuǎn)移。張文喆等[21-22]以復(fù)合磷脂酶法(磷脂酶A1+磷脂酶A2)制備L-α-GPC。這種方法雖然未能提高得率，但縮短了反應(yīng)時(shí)間，相對提高了生產(chǎn)效率。周雯君等[23]以磷脂酶A1和磷脂酶A2為復(fù)合酶，在水相及非均相微乳體系下分別酶解制備L-α-GPC，得到了最佳工藝條件。Blasi等[24]在微乳體系中，堿性條件下使用磷脂酶A1、A2通過酶解脫?；磻?yīng)制備L-α-GPC，轉(zhuǎn)化率較高。

1.2 化學(xué)合成法

Puricelli[25]以D-亞異丙基甘油對甲苯磺酸酯為起始原料，與磷酸膽堿四甲基銨鹽反應(yīng)，一步制備L-α-GPC，收率達(dá)到75%。Song等[26]應(yīng)用shapless環(huán)氧開環(huán)反應(yīng)原理，用(R)-(+)縮合甘油與磷酸膽堿在異丙胺存在條件下通過親核加成制備L-α-GPC。

李海林等[27]利用(R)-環(huán)氧氯丙烷與芐醇在強(qiáng)堿作用下縮合制備(S)-芐基縮水甘油醚，然后將(S)-芐基縮水甘油醚與氯化磷酸膽堿反應(yīng)制得L-α-氯化甘油磷酸膽堿芐基醚；再將所得到的L-α-氯化甘油磷酸膽堿芐基醚通過Pd/C加氫反應(yīng)脫去芐基保護(hù)基，最后純化即得L-α-GPC。蘇福男[28]利用一種氯化磷酰膽堿鈣鹽和(R)-(-)-3-氯-1，2-丙二醇為原料，通過膜分離除去氯化鈉等雜質(zhì)，最后經(jīng)過離子交換樹脂進(jìn)行分離制備甘油磷脂酰膽堿，產(chǎn)品純度可達(dá)到99.7%。艾海馬等[29]以D-甘露糖醇為原料，經(jīng)縮酮化、氧化、還原制得D-亞異丙基甘油，再與2-氯-2-氧-1，3，2-環(huán)氧磷戊烷進(jìn)行酯化反應(yīng)，然后用三甲胺進(jìn)行氨化，最后水解除去丙叉基得目標(biāo)化合物L(fēng)-α-GPC，總收率從9.5%提高到38.6%(以D-甘露糖醇計(jì))。

在以磷脂酰膽堿為原料利用合適的催化劑催化脫酰，再進(jìn)行?；D(zhuǎn)移制備L-α-GPC的工藝中，原料通常為磷脂酰膽堿，無毒無害，產(chǎn)物收率高。但是原料純度要高，否則將會(huì)生成很多副產(chǎn)物，影響產(chǎn)品純度并對后期的分離提純造成困難，并且溶劑的回收耗能大，催化劑價(jià)格高。另外，水解過程中可能造成手性結(jié)構(gòu)消旋，導(dǎo)致產(chǎn)品旋光度不合格?；瘜W(xué)合成法制備L-α-GPC，產(chǎn)品純度高，分離純化容易，但是工藝復(fù)雜，操作條件苛刻，部分原料有毒，中間體不易得，對工業(yè)化生產(chǎn)造成一定影響。

2 L-α-GPC的分離純化方法

2.1 傳統(tǒng)方法

通過酯交換反應(yīng)制備GPC工藝中，反應(yīng)液中存在其他中性脂類以及脂肪酸甲酯等[30]，同時(shí)由于原料中往往伴有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等雜質(zhì)，所以水解產(chǎn)物中也含有甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酰絲氨酸(GPS)、甘油磷脂酰肌醇(GPI)，與目標(biāo)產(chǎn)物GPC的極性相似，利用簡單的溶劑萃取[31]很難去除這些雜質(zhì)。早期分離方法主要有沉淀法、重結(jié)晶法、溶劑萃取法。這些方法在純化GPC時(shí)存在自身的優(yōu)缺點(diǎn)：溶劑萃取法利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，但很難制備出高純度的GPC，萃取過程需要消耗大量有機(jī)溶劑，溶劑的回收也將產(chǎn)生很高的能耗；沉淀法主要利用氯化汞等可溶性汞鹽進(jìn)行分離雜質(zhì)，重金屬離子的引入和殘留對醫(yī)藥級GPC的開發(fā)是不符合要求的；重結(jié)晶法是將含有水的液態(tài)粗GPC用乙醇等溶劑溶解后，蒸發(fā)結(jié)晶提純GPC，在工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)方面滿足不了要求。以上方法對產(chǎn)品純度和旋光性都達(dá)不到市場需求，無法商業(yè)化生產(chǎn)，現(xiàn)已逐漸被淘汰。

2.2 柱色譜層析法

柱色譜層析法分為硅膠柱層析法、氧化鋁柱層析法、離子交換樹脂柱層析法，以及將兩種填料進(jìn)行聯(lián)合層析法。離子交換樹脂柱層析法操作簡單，回收率高，可重復(fù)性使用，并能分離性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物質(zhì)，如分離異構(gòu)體，特別適用于L-α-GPG的純化分離操作[32]。

Liu等[33]利用磷脂酶A1酶法水解，然后用離子交換樹脂純化和硅膠柱層析法制備純度高達(dá)99.8%的L-α-GPC，最終收率高達(dá)78.4%。Zhang等[34]利用D001和D301-111陰離子交換樹脂柱層析法純化磷脂酶A1催化水解產(chǎn)物，利用活性炭進(jìn)行脫色并去除小顆粒雜質(zhì)，得到純度高達(dá)98.8%的L-α-GPC。周麗等[35]采用以離子交換樹脂為分離介質(zhì)的柱層析法及活性炭脫色法，對粉末磷脂的醇解反應(yīng)液進(jìn)行分離純化。通過篩選，確定了D001樹脂為第一層析柱的分離介質(zhì)，201×7樹脂為第二層析柱的分離介質(zhì)，然后利用D113柱對L-α-GPC粗溶液進(jìn)一步純化，最后經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥可得到純度達(dá)97.1%的L-α-GPC，回收率為84.8%。

但離子交換樹脂對L-α-GPC、GPE和LPC的分離度相對來說仍然不是很高，導(dǎo)致產(chǎn)品的回收率低，整個(gè)純化周期長[36]。

3 L-α-GPC的分析檢測方法

3.1 定性分析

對于油狀的L-α-GPC，可利用傳統(tǒng)的檢測手段如紅外光譜(IR)、核磁共振譜(1H-NMR，1H-1H COSY，13C-NMR，13C-DEPT，13C-1H HSQC，13C-1H HMBC，31P-NMR)、質(zhì)譜(ESI+離子源，220℃)、LC-MS、旋光度測定、薄層色譜等技術(shù)對L-α-GPC進(jìn)行定性表征[37]。另外，在利用磷脂酶A1催化水解PC過程當(dāng)中，Ca2+是必需的輔酶因子[38-39]，需要除去，原子吸收光譜可以作為輔助手段對產(chǎn)品中Ca2+含量進(jìn)行監(jiān)測[37]，為L-α-GPC生產(chǎn)過程中雜質(zhì)控制提供依據(jù)。

然而對于晶體狀態(tài)的L-α-GPC很難利用以上方法進(jìn)行表征。Oh等[40]公開了一種制備Ⅰ、Ⅱ晶型L-α-GPC晶體的方法，并利用差示掃描量熱儀(DSC)進(jìn)行表征，Ⅰ晶型L-α-GPC初始溫度147℃并在150℃有吸收峰，Ⅱ晶型初始溫度為62℃并在66℃處有吸收峰；利用X射線衍射法(XRD)對產(chǎn)品進(jìn)行定性分析，Ⅰ晶型L-α-GPC在衍射角為(9.8±0.2)°、(12.0±0.2)°、(14.3±0.2)°、(15.8±0.2)°、(19.6±0.2)°處有特征峰，Ⅱ晶型在衍射角為(10.3±0.2)°、(12.2±0.2)°、(13.4±0.2)°、(14.8±0.2)°、(20.6±0.2)°處有特征峰，確證了兩種晶型結(jié)構(gòu)。由于晶體狀態(tài)的L-α-GPC相比傳統(tǒng)的油狀L-α-GPC純度更高，同時(shí)該晶體吸濕性低，存儲(chǔ)期間具有良好的穩(wěn)定性，所以更易保存。

趙成磊[41]以油狀甘油磷酸膽堿為原料，將過氧化鋁層析柱后的L-α-GPC油狀物粗品通過兩步結(jié)晶法制備L-α-GPC單晶純品，用CuKα(λ=1.541 84×10-10m)光源收集(150±2)K溫度下的X射線單晶衍射數(shù)據(jù)，在4.89°≤θ≤69.75°范圍內(nèi)收集4 137個(gè)衍射點(diǎn)，其中2 204個(gè)[R(int)=0.012 6]獨(dú)立點(diǎn)。X射線單晶衍射結(jié)果表明該化合物為正交晶系，對L-α-GPC晶型進(jìn)行了補(bǔ)充，為今后的L-α-GPC在制劑中晶型的選擇提供了參考。

3.2 定量分析

高效液相色譜法是現(xiàn)今普遍采用的定性、定量分析L-α-GPC的方法。由于L-α-GPC在200～800 nm全波長范圍內(nèi)沒有紫外吸收峰，不能用紫外檢測器對其檢測，所以可以用HPLC-ELSD對其定性或者定量分析[42-43]，但是該方法使用的流動(dòng)相一般含有水，對硅膠色譜柱的柱效有一定的損害作用，造成檢測結(jié)果穩(wěn)定性差，并且PC、LPC、L-α-GPC吸水性強(qiáng)，進(jìn)一步增加結(jié)果的誤差。核磁共振氫譜法可以解決此問題，不但避免了樣品中水分對檢測結(jié)果的干擾，還可以分別選取化學(xué)位移δ=4.40～4.50、4.14～4.16、3.76～3.83處的信號(hào)峰作為PC、LPC和L-α-GPC的特征性質(zhì)子峰，并根據(jù)質(zhì)子峰相對面積與物質(zhì)的量的對應(yīng)關(guān)系計(jì)算三者的相對含量[44]，為PC兩步水解過程中檢測L-α-GPC產(chǎn)率提供了一種簡單快速的方法。

劉丹等[45]建立了一種非水電位滴定測定L-α-GPC含量的方法，采用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液對L-α-GPC樣品進(jìn)行電位滴定，然后利用二級微商法找到點(diǎn)位突躍點(diǎn)，確定電位滴定終點(diǎn)消耗的高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積[46]，從而得出L-α-GPC含量，實(shí)驗(yàn)精密度較高，并且不受溶液渾濁度影響，可以作為定量分析L-α-GPC的新方法。

通常定性和定量分析L-α-GPC可將多種方法聯(lián)用，以提高檢測的準(zhǔn)確性和可信度。

4 結(jié)束語

醫(yī)藥、食品、保健品等領(lǐng)域?qū)α字捌涓男援a(chǎn)品L-α-GPC都具有很大的需求，并且在未來將有更大的市場。國內(nèi)有關(guān)L-α-GPC的制備、純化、檢測技術(shù)不是十分成熟，所以研發(fā)適用于大規(guī)模生產(chǎn)L-α-GPC的新工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量，探索簡便、快速的檢測方法具有重要意義。

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Advanceinpreparation,purificationanddetectionofL-α-glycerylphosphorylcholine

KANG Shizong1, ZHANG Haichen2, WU Yonghui3, GU Keren1,2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China; 2.Jilin Engineering Vocational College, Siping 136001, Jilin, China; 3.Guangzhou Yide Biological Technology Co., Ltd., Guangzhou 511340, China)

L-α-glycerophosphorylcholine (L-α-GPC) is a type of water-soluble phospholipid metabolite, which naturally exists in the animal body, and it is also the choline source of preparing the acetylcholine. It can not only enhance the people’s memory and cognitive abilities, but also prevent and treat lots of diseases. It will be difficult to meet the market demand of high-quality and high-purityL-α-GPC without the mature technology of preparation, purification and detection. The methods of preparation, purification and detection ofL-α-GPC at home and abroad were summarized, in order to provide support to the development ofL-α-GPC and related products.

L-α-glycerophosphorylcholine; preparation; purification; detection

2016-11-17

康世宗(1991)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物開發(fā)(E-mail)18236920553@163.com。

谷克仁，教授(E-mail)gukeren988@163.com。

Q545;TQ645.9

：A

1003-7969(2017)08-0103-05