李嬋娟

摘要：目的通過(guò)對(duì)金釵石斛的提取物和粗提物分別進(jìn)行抗血小板聚集活性篩選和全血凝血實(shí)驗(yàn)，探討金釵石斛的抗血栓作用。方法采用ADP誘導(dǎo)大鼠體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)小鼠全血凝血時(shí)間來(lái)評(píng)判金釵石斛的抗血栓作用。結(jié)果對(duì)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集有一定抑制趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在測(cè)定全血凝血時(shí)間時(shí)，6.0 g/kg劑量組明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間，具有顯著的抗凝作用（P<0.05）。結(jié)論金釵石斛在血栓性疾病中具有一定的積極作用，但活性成分的篩選有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：金釵石斛；抗血栓；藥效篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）09-0060-03

【Abstract】Objective： To study the anti-thrombotic effect of Dendrobium nobile by screening anti-platelet aggregation activity and total blood clotting experiment through the extract and crude extract of Dendrobium nobile. Methods： The anti-thrombotic effect of Dendrobium nobile was evaluated by ADP-induced platelet aggregation in vitro and the time of whole blood clotting in mice. Results： There was certain control tendency for platelet aggregation induced by inducer， but it was not statistically significant when compared with the blank control group. In the determination of whole blood clotting time， 6.0g/kg dose group significantly prolonged clotting time， with significant anticoagulant effect（P<0.05）. Conclusion： Dendrobium nobile has a positive effect on thrombotic diseases， but the screening of active ingredients needs further study.

【Key words】Dendrobium nobile， antithrombotic， drug effect screening

石斛藥用歷史悠久，始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，列為上品，“主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞羸瘦，強(qiáng)陰，久服厚腸胃?！崩顣r(shí)珍在《本草綱目》中亦有收載[2]，其有養(yǎng)胃生津、滋陰清熱、明目的功能，用于陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等癥狀。如今石斛仍被廣泛應(yīng)用，諸多中成藥如：脈絡(luò)靈，通塞脈片，石斛散，石斛夜光丸，清咽寧，養(yǎng)陰口服液，以及一些名貴飲料等均以石斛為主要成分或含有石斛。金釵石斛作為藥典石斛之一，在臨床上和中藥復(fù)方中被廣泛應(yīng)用，特別是其抗氧化作用在氧化損傷類(lèi)疾病中的應(yīng)用得到廣泛的認(rèn)可，而在治療心腦血管疾病中，抗血栓和抗氧化是對(duì)抗此類(lèi)疾病的關(guān)鍵點(diǎn)，本文以具有較好抗氧化作用的金釵石斛為研究對(duì)象，進(jìn)一步探討金釵石斛是否具有抗血栓相關(guān)的藥理作用，從而為金釵石斛應(yīng)用于心腦血管疾病提供藥理學(xué)依據(jù)。

1金釵石斛資源簡(jiǎn)介

金釵石斛[3]Dendrobium nobile Lindl.莖叢生，上部稍扁而稍彎曲上升，高10～60 cm，粗達(dá)1.3 cm，具槽紋，節(jié)略粗，基部收窄。葉近革質(zhì)，長(zhǎng)圓形或長(zhǎng)橢圓形，長(zhǎng)6 cm～12 cm，寬1 cm～3 cm，先端2圓裂，花期有葉或無(wú)葉?？偁罨ㄐ蛴谢?-4朵；花大，下垂，直徑達(dá)8 cm，花被片白色帶淺紫色，先端紫紅色；唇瓣倒卵狀矩圓形，長(zhǎng)4 cm～4.5 cm，寬3 cm～3.5 cm，先端圓形，唇盤(pán)上面具1紫斑；花藥2室，花粉塊4個(gè)?；ㄆ?-4月。

2金釵石斛抗血小板聚集的藥理作用

2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋狙芯恐荚谟^察與評(píng)價(jià)金釵石斛中幾種化學(xué)成分對(duì)誘導(dǎo)劑所致血小板聚集的影響，結(jié)合原藥材的活性篩選結(jié)果，初步分析物質(zhì)基礎(chǔ)與活性的相關(guān)性。

2.2實(shí)驗(yàn)材料

2.2.1受試物金釵石斛提取成分：jc1、jc2。以上受試樣品均為粉末狀，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物所提供。用二甲亞砜溶解成飽和溶液為最高濃度，再小量分裝，低溫凍存，臨用前以相同溶媒倍比稀釋成各濃度供體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)用。

2.2.2對(duì)照品Aspirin（ASP），100 mg/片，批號(hào)：J20130078，拜耳公司生產(chǎn)。用二甲亞砜溶解成飽和溶液為最高濃度，再用相同的溶媒倍比稀釋成各濃度供體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.3誘導(dǎo)劑ADP，sigma，批號(hào)：A2754。ADP用生理鹽水配成3000 umol/L濃度，于-20℃以下小量分裝，低溫凍存。臨用前復(fù)溶，并用生理鹽水稀釋至300 umol/L。

2.2.4動(dòng)物

2.2.4.1品系及來(lái)源SPF級(jí)SD大鼠，雌雄兼用，體重250～350 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）k2015-0002，發(fā)證機(jī)關(guān)：云南省科學(xué)技術(shù)廳。

2.2.4.2飼養(yǎng)條件大鼠飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25℃（日溫差≤3℃），濕度40%～70%，照明12 h：12h明暗交替，照度150～300 lx，噪音≤60 dB。endprint

2.2.4.3飼養(yǎng)管理大鼠用透明塑料盒群養(yǎng)，每箱≤6只，每日喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料。豚鼠采用不銹鋼絲籠飼養(yǎng)，雌雄分籠，每籠5只，每日喂飼、喂水一次并給予青草適量，每日更換籠具和墊料。

2.2.5主要儀器AL104電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ2000型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；Eppendorf離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；LBY-NJ4血小板聚集儀，北京普利生儀器有限公司；BCD-193冰箱，合肥榮事達(dá)電冰箱有限公司；Millipore超純水處理系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；101-2EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

2.2.6主要試劑氯化鈉注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字H53020469，500mL/瓶，昆明南疆制藥有限公司；二甲亞砜，上海試劑廠；枸櫞酸鈉，天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)091107；水合氯醛，天津市瑞金特化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090814。

2.2.7數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)用DAS1.0軟件處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，方差齊用t檢驗(yàn)，方差不齊用t，檢驗(yàn)；偏態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。

2.3方法與結(jié)果

2.3.1對(duì)ADP誘導(dǎo)大鼠體外血小板聚集的影響參考文獻(xiàn)方法[4]，預(yù)先將玻璃比濁管和攪拌珠用1%的硅油甲苯溶液硅化烘干后，挑選透光值相近的比濁管備用。將SD大鼠以300 mg/kg.bw劑量腹腔注射水合氯醛麻醉后，頸總動(dòng)脈插管取血，用3.8%的枸櫞酸鈉1：9抗凝，以3000 r/min離心3min，取出上層富血小板血漿（PRP）后，剩余部分再以4000 r/min離心10 min，管中上清液即為貧血小板血漿（PPP）。取200 ul的PRP置于比濁管內(nèi)，每管加入不同濃度的各受試物藥液2 uL，對(duì)照管PRP中加入2 uL二甲基亞砜。測(cè)定時(shí)先用PPP（加入與PRP管相同的溶液2 uL，消除受試物自身顏色的干擾）調(diào)零，然后將PRP標(biāo)本放入測(cè)定孔，加入攪拌珠，在37℃溫育5min后加入ADP誘導(dǎo)劑5ul（終濃度為7.246 umol/L），檢測(cè)對(duì)照管與給藥管PRP在5 min內(nèi)的最大聚集率，并計(jì)算血小板聚集的抑制率和各受試物的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果見(jiàn)表1-2。

血小板聚集抑制率（%）=（對(duì)照組最大聚集率-給藥組最大聚集率）/對(duì)照組最大聚集率×100%

由表1可見(jiàn)，0.882～0.11mmol/l濃度的jc1對(duì)ADP誘導(dǎo)大鼠的體外血小板聚集有一定抑制趨勢(shì)，但無(wú)明顯劑量依賴(lài)性；因其最高濃度的抑制率低于50%，故無(wú)法計(jì)算出IC50。

由表2可見(jiàn)，0.970～0.121 mmol/L濃度的jc2對(duì)ADP誘導(dǎo)大鼠的體外血小板聚集有一定抑制趨勢(shì)，但無(wú)劑量依賴(lài)性；因其最高濃度的抑制率低于50%，故無(wú)法計(jì)算出IC50。

3金釵石斛對(duì)小鼠全血凝血時(shí)間的影響

選用18～20 g雄性昆明種小鼠44只，按體重隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組；陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林40 mg/kg組；石斛樣品粗提物3.0 g/kg組；石斛樣品粗提物6.0 g/kg組；每組11只。給藥組動(dòng)物每日分別按3.0 g/kg，6.0 g/kg干燥藥材劑量灌胃給藥一次，連續(xù)3d，空白對(duì)照組灌服等容量1%CMC-Na 20ml/kg.bw。末次給藥后1h，用20ul采血管于每鼠眼后靜脈叢取血，以毛細(xì)管法測(cè)定凝血時(shí)間。結(jié)果表明，3.0 g/kg的低劑量組僅有延長(zhǎng)趨勢(shì)而無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，6.0 g/kg的高劑量組延長(zhǎng)率79.45%，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

4討論

金釵石斛的兩種提取物在進(jìn)行抗血小板聚集活性篩選時(shí)，對(duì)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集有一定抑制趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。金釵石斛的粗提物測(cè)定全血凝血時(shí)間時(shí)，6.0 g/kg劑量組明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間，具有顯著的抗凝作用。從這一結(jié)果可看出，金釵石斛在血栓性疾病中具有一定的積極作用，而在抗血小板聚集實(shí)驗(yàn)中未顯示出較好的效果，這可能與我們提取條件有限，從金釵石斛中提取的成分種類(lèi)過(guò)少，而已提取的這兩種成分均不是金釵石斛抗血小板聚集的最佳活性物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

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[4]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1119.endprint