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(1.四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000;2.四川化工職業(yè)技術(shù)學院,四川瀘州 646000)

復(fù)合菌發(fā)酵對野生獼猴桃果酒風味物質(zhì)的影響

張晶1,左勇1,*,謝光杰2,張鑫1,孫時光1,瞿嬌嬌1

(1.四川理工學院生物工程學院,四川自貢 643000;2.四川化工職業(yè)技術(shù)學院,四川瀘州 646000)

本文主要研究復(fù)合菌發(fā)酵對野生獼猴桃果酒風味物質(zhì)的影響?？疾炝税l(fā)酵溫度、SO2添加量、糖度及酵母菌復(fù)合比例對果酒質(zhì)量的影響,通過正交實驗,得到最佳發(fā)酵工藝條件為:溫度26 ℃,SO2添加量80 mg/L,糖度210 g/L,安琪酵母與酵母菌TP6復(fù)合比為2∶1,在此條件下酒精度可達10.6%vol,酒體風味理想。采用復(fù)合菌和安琪酵母發(fā)酵的果酒,經(jīng)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜鑒定,分別檢測到35、24種化合物,并以醇類、酯類為主。

獼猴桃果酒,復(fù)合菌,發(fā)酵,香氣成分

獼猴桃屬漿果類水果,芳香多汁,富含糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、黃酮、多酚、有機酸,尤以維生素C居多,具有抗氧化功效[1]。野生獼猴桃在我國廣泛分布于西部和南部山地,在河南、四川等地也有大量野生獼猴桃種植[2]。由于野生獼猴桃易腐爛,存儲時間短,用于鮮食又不具優(yōu)勢,每年都有大量果實損失[3]。因此,利用豐富的野生獼猴桃資源,因地制宜開展精深加工,是解決鮮果過剩的有效途徑,目前將野生獼猴桃加工生產(chǎn)果酒,已取得階段性成果。

在果酒生產(chǎn)過程中,菌種將直接決定著產(chǎn)品成本和產(chǎn)品質(zhì)量[4]。由于單菌種發(fā)酵的果酒風味淡薄,不能滿足消費者的認可,因此采用復(fù)合菌發(fā)酵生產(chǎn)果酒,能較好地彌補果酒風味不足的缺陷。在果酒發(fā)酵過程中,不同菌種相互作用,能產(chǎn)生豐富的芳香物質(zhì)和風味成分,賦予果酒特定風味[5-7]。Iris Loira等[8]將粟酒裂殖酵母和德布爾有孢酵母混合菌株用于紅葡萄酒連續(xù)發(fā)酵,能增加多元醇的合成,增加香氣。黃國清等[9]探討幾種酵母固定化發(fā)酵含酸量較高的西番蓮果汁制作干型西番蓮果酒的發(fā)酵工藝,取得了較好效果。為充分利用野生獼猴桃資源,釀造獨具風味的獼猴桃果酒,本研究擬采用復(fù)合菌對野生獼猴桃進行發(fā)酵,采用正交實驗優(yōu)化野生獼猴桃果酒發(fā)酵工藝,并利用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對比分析復(fù)合菌發(fā)酵果酒和單酵母發(fā)酵果酒的香氣成分,以探究復(fù)合菌發(fā)酵對野生獼猴桃果酒品質(zhì)及風味物質(zhì)的影響,為野生獼猴桃果酒的進一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料和儀器

野生獼猴桃原產(chǎn)地為宜賓市,呈橢球形,長度為5～7 cm,果實平均質(zhì)量在80 g左右;酵母菌TP6 實驗室保存;安琪酵母 安琪酵母(伊犁)有限公司;PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1000 mL;YPD液體培養(yǎng)基:蛋白胨2%,葡萄糖2%,酵母膏1%,pH4.5～5.0。

AR1140電子天平 托利多儀器(上海)有限公司;GZ-250-HS11恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;手持糖度計 成都格納絲商貿(mào)有限公司;XSP-1600X光學顯微鏡 廣州新怡光學顯微鏡廠家;50 μm/30 μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司;Agilent6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.2野生獼猴桃果酒釀造工藝流程

野生獼猴桃→選果→洗果→破碎打漿→成分調(diào)整→主發(fā)酵→分離→后發(fā)酵→初濾→調(diào)整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→滅菌[10]

1.3實驗方法

1.3.1 野生獼猴桃果漿的制備與酶處理 挑選完整無腐爛的野生獼猴桃,清洗、打漿,用檸檬酸與碳酸鈉溶液調(diào)整果漿pH為4.0,加入0.6%果膠酶,于45 ℃酶解1.5 h,冷卻至常溫備用。

1.3.2 酵母菌比例的配制 從斜面挑取少量酵母菌TP6和安琪酵母于YPD液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1 d,通過血球計數(shù)板對酵母菌進行計數(shù),并按預(yù)定比例進行混合,使每毫升培養(yǎng)液酵母菌數(shù)量達到1×108個。

1.3.3 單因素實驗 溫度:在裝有350 mL野生獼猴桃果漿的錐形瓶中加入白砂糖150 g/L、SO260 mg/L,復(fù)合酵母菌2 mL(1∶1),溫度控制在20、22、24、26、28、30、32 ℃,發(fā)酵10 d,發(fā)酵結(jié)束時測定果酒酒精度、殘?zhí)呛?并對其進行感官評價。

SO2:在裝有350 mL野生獼猴桃果漿的錐形瓶中加入白砂糖150 g/L、SO2添加量分別為40、60、80、100、120、140、160 mg/L,復(fù)合酵母菌2 mL(1∶1),于24 ℃條件下發(fā)酵10 d,發(fā)酵結(jié)束時測定果酒酒精度、殘?zhí)呛?并對其進行感官評價。

糖添加量:在裝有350 mL野生獼猴桃果漿的錐形瓶中分別加入白砂糖60、90、120、150、180、210、240 g/L,SO260 mg/L,復(fù)合酵母菌2 mL(1∶1),于24 ℃條件下發(fā)酵10 d,發(fā)酵結(jié)束時測定果酒酒精度、殘?zhí)呛?并對其進行感官評價。

酵母菌復(fù)合比:在裝有350 mL野生獼猴桃果漿的錐形瓶中加入白砂糖150 g/L,SO260 mg/L,復(fù)合酵母菌分別按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的量接入2 mL,于24 ℃條件下發(fā)酵10 d,發(fā)酵結(jié)束時測定果酒酒精度、殘?zhí)呛?并對其進行感官評價。

1.3.4 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,設(shè)計L9(34)正交實驗,研究不同發(fā)酵條件對果酒品質(zhì)的影響。以酒精度、感官評分為考察指標,通過權(quán)重計算得野生獼猴桃果酒綜合評分。正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels Table of orthogonal experiment

1.3.5 單菌株與復(fù)合菌株發(fā)酵生產(chǎn)野生獼猴桃果酒香氣成分比較 在野生獼猴桃果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化基礎(chǔ)上,分別向獼猴桃果漿中加入復(fù)合菌株和安琪酵母進行獼猴桃果酒發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束時采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對比分析復(fù)合菌發(fā)酵果酒和單酵母發(fā)酵果酒的香氣成分。

1.3.6 野生獼猴桃酒樣香氣成分提取 頂空固相微萃取:用0.45 μm膜過濾酒樣,吸取5 mL待測樣品于15 mL頂空瓶,加入1 g NaCl,置于恒溫磁力攪拌加熱平臺上。將萃取頭插入樣品瓶的頂空部分,于40 ℃下吸附30 min。將萃取頭插入氣相色譜進樣口,于230 ℃熱解析8 min。

1.3.7 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析條件 色譜條件:毛細管色譜柱為DB-WAX,規(guī)格為60 m×250 μm×0.25 μm;手動無分流進樣,進樣口溫度為230 ℃;程序升溫:35 ℃保持3 min,然后6 ℃/min升溫到150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min升溫到230 ℃,保持5 min;載氣:高純度氦氣,流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:EI電子源,電子能量70 ev,質(zhì)量掃描范圍在20～550 u;離子源溫度230 ℃,接口溫度230 ℃。

香氣物質(zhì)定性定量分析:利用全離子圖譜,結(jié)合已有標樣的色譜保留時間、質(zhì)譜信息及NIST05標準譜庫,對野生獼猴桃果酒中的揮發(fā)性物質(zhì)進行定性分析。最后采用氣相色譜峰面積歸一化法確定各揮發(fā)性組分的相對含量。

1.3.8 測定方法 酒精度:酒精計法;糖度:高精度手持糖量計;殘?zhí)?斐林試劑滴定法;酸度:精密級數(shù)字式酸度計直接測定;感官評分[11]。

1.3.9數(shù)據(jù)分析方法 根據(jù)正交試驗結(jié)果，分別計算酒精度和感官評定隸屬度。

酒精度或感官評定隸屬度=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中X為待計算隸屬度的酒精度或感官評定值，Xmax為正交試驗中最大酒精度或感官評定值，Xmin為正交試驗中最小酒精度或感官評定值。

酒精度權(quán)重[12]取0.4，感官評定權(quán)重取0.6，分別對不同發(fā)酵條件下的野生獼猴桃果酒進行綜合評分，即綜合評分=酒精度隸屬度×0.4+感官評定隸屬度×0.6，采用IBM SPSS Statistics 19對評分結(jié)果進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

在傳統(tǒng)溯源過程中，使用人工進行手寫記錄是生產(chǎn)階段信息監(jiān)測的常態(tài)，人工手寫的方式不但效率較為低下并且往往具有一定的錯誤率。所以本設(shè)計將使用二維碼掃碼進行數(shù)據(jù)獲取，使得數(shù)據(jù)的記錄方式從人工手寫記錄轉(zhuǎn)為數(shù)字化的方式，來提高數(shù)據(jù)錄入效率和準確率。針對相關(guān)數(shù)據(jù)查詢的手機端的實現(xiàn)方式通過不同階段的掃碼來與服務(wù)器端自動進行數(shù)據(jù)獲取，從而實現(xiàn)茶葉信息的溯源。手機客戶端掃碼流程實現(xiàn)界面如下所示。

2.1.1 溫度對獼猴桃果酒發(fā)酵的影響 溫度是影響酵母生長、繁殖、代謝的重要因素。溫度過低會抑制酵母的生長、繁殖,造成起酵慢,糖降解速率低;溫度過高時,發(fā)酵劇烈,易帶走果香,酯香形成少,從而導致酒體香氣欠缺、粗糙,成品酒的風味和口感較差[12-13]。由圖1可知,當發(fā)酵溫度在20～26 ℃之間時,酒精度逐漸升高,殘?zhí)呛恐饾u降低,而當發(fā)酵溫度超過28 ℃,酒精度明顯下降。當溫度適宜時,復(fù)合菌正常產(chǎn)酒,溫度過高或過低都會抑制復(fù)合菌的發(fā)酵,從而影響糖向酒精的轉(zhuǎn)化。

圖1 不同溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.1 The effects of different temperature on fermentation results

2.1.2 SO2添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響 在果汁發(fā)酵前,通常要加入適量的SO2,以抑制雜菌的生長、繁殖與代謝,保證發(fā)酵的順利進行,此外,SO2還有澄清、抗氧化、增酸、使色素溶出等作用[14]。由圖2可知,當SO2添加量小于60 mg/L時,酒精度隨著SO2的增加而上升,當SO2添加量超過80 mg/L時,酵母受到抑制,酒精度開始下降,殘?zhí)呛恳仓饾u增加。

圖2 不同SO2添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.2 The effects of different amounts ofSO2 on fermentation results

2.1.3 糖度對發(fā)酵結(jié)果的影響 糖添加量直接影響果酒酒精度及其品質(zhì)。適宜的糖度使發(fā)酵正常進行,而糖度過高會改變細胞滲透壓,引起酵母發(fā)酵異常,從而影響果酒的質(zhì)量[15]。由圖3可知,隨著糖添加量的增加,酒精度逐漸上升,殘?zhí)呛恳蚕鄳?yīng)增加。當糖添加量超過210 g/L時,酒精度呈下降趨勢。其原因可能是隨著糖含量增大,細胞滲透壓也隨之增加,這極大影響了酵母菌的代謝,導致了酒精度的下降。

圖3 不同糖添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.3 The effects of different amounts ofsugar on fermentation results

2.1.4 酵母菌不同復(fù)合比對發(fā)酵結(jié)果的影響 酵母對果酒的品質(zhì)和質(zhì)量影響非常大,酵母性狀直接影響到所釀果酒的風味與口感,決定果酒品質(zhì)。采用純種酵母釀造的果酒口味過于平淡,而復(fù)合菌種發(fā)酵會影響發(fā)酵速率和糖降解速度,同時能產(chǎn)生更豐富的芳香物質(zhì)和風味成分[16]。由圖4可知,當安琪酵母與酵母菌TP6的比例為3∶1時,發(fā)酵效果較好,酒精度最高,殘?zhí)呛枯^低。隨著酵母菌TP6比例的增大,酒精度雖然有所下降,但酒體芳香味卻在逐漸變濃,表明酵母菌TP6的產(chǎn)酒能力雖然較安琪酵母差一些,但產(chǎn)香能力卻比安琪酵母強。

圖4 酵母不同復(fù)合比對發(fā)酵結(jié)果的影響Fig.4 The effect of different compositeyeast on fermentation results

2.2正交實驗

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

根據(jù)正交實驗結(jié)果可知,發(fā)酵條件對實驗結(jié)果影響從大至小分別為糖度、溫度、酵母菌復(fù)合比、SO2添加量。由方差分析可知,糖度對實驗結(jié)果影響較為顯著,影響較弱的是SO2添加量和酵母復(fù)合比。根據(jù)正交實驗結(jié)果,復(fù)合菌發(fā)酵的野生獼猴桃果酒最佳工藝水平組合為A2B3C3D1。對最優(yōu)組合進行驗證,結(jié)果均較正交實驗中的其它組更優(yōu),酒精度平均值可達10.6%vol,其感官評分達89,其綜合分為1.094。從驗證結(jié)果看,正交實驗得出的最佳組合是可靠的。

采用頂空固相微萃取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對單一菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵的野生獼猴桃果酒中的香氣成分分別進行檢測,得到揮發(fā)性香氣成分總離子流圖,如圖5、圖6所示。

圖5 單一菌種發(fā)酵果酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.5 The total volatile components ion spectra ofsingle strain fermentation fruit wine

圖6 復(fù)合菌種發(fā)酵果酒揮發(fā)性成分總離子圖譜Fig.6 The total volatile components ion spectra ofmultiple strains fermentation fruit wine

通過對比總離子圖譜可知,采用復(fù)合菌發(fā)酵的野生獼猴桃果酒峰數(shù)目要比采用單一菌種發(fā)酵果酒峰數(shù)目多,這說明采用復(fù)合菌發(fā)酵可以增加果酒中的風味物質(zhì)。

2.4兩種不同的發(fā)酵方法發(fā)酵野生獼猴桃果酒香氣成分對比

安琪酵母發(fā)酵的果酒經(jīng)鑒定共檢測出24種揮發(fā)性成分,其中酯類物質(zhì)7種、醇類物質(zhì)13種,其他香氣物質(zhì)4種,相對含量分別占總揮發(fā)性香氣物質(zhì)的4.040%、95.048%、0.912%。安琪酵母與酵母菌TP6復(fù)合發(fā)酵的野生獼猴桃果酒中,共檢測出35種揮發(fā)性成分,其中酯類物質(zhì)11種、醇類物質(zhì)13種,其他香氣物質(zhì)11種,相對含量分別占總揮發(fā)性香氣物質(zhì)的2.072%、94.310%、3.618%。

表4 不同酒樣揮發(fā)性成分對比Table 4 The volatile compositioncontrast of different wine samples

通過對香氣成分分析,兩種果酒揮發(fā)性香氣成分在種類和含量上既有共同特點,也存在差異。兩種果酒中共同檢出的主要香氣物質(zhì)為乙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、正己酸乙酯等,在果酒中的含量比較高。相比單菌種發(fā)酵的果酒,復(fù)合菌發(fā)酵的果酒揮發(fā)性香氣成分多11種。兩種果酒中,醇類物質(zhì)數(shù)量相同,但種類有所不同,其中乙醇含量基本持平,表明添加TP6對果酒中乙醇含量影響不大,而復(fù)合菌發(fā)酵的果酒中異丁醇、異戊醇等高級醇含量低于單菌株發(fā)酵的果酒,可能是由于TP6的加入,部分高級醇被利用,轉(zhuǎn)化為其他風味物質(zhì)。酯類物質(zhì)中,復(fù)合菌發(fā)酵的果酒比純菌種發(fā)酵的果酒多4種,表明添加TP6有利于果酒的增香增酯,其原因可能是在發(fā)酵過程中TP6利用部分醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酯,賦予果酒濃厚的酯香,促進果酒風味提升。其它揮發(fā)性物質(zhì)中,復(fù)合菌發(fā)酵的野生獼猴桃果酒多7種,表明TP6的加入,豐富了果酒中物質(zhì)代謝途徑,從而產(chǎn)生更多風味成分。因此,利用復(fù)合菌進行野生獼猴桃果酒發(fā)酵生產(chǎn)果酒,由于微生物代謝更加活躍,物質(zhì)代謝過程更加復(fù)雜,從而產(chǎn)生更豐富的香氣成分,口感醇厚,香氣濃郁。

3 結(jié)論

本研究采用安琪酵母再配以一定量的酵母菌TP6,采取復(fù)合菌進行野生獼猴桃果酒發(fā)酵,野生獼猴桃的最適發(fā)酵條件為:在發(fā)酵溫度26 ℃,SO2添加量80 mg/L,糖添加量210 g/L,復(fù)合菌比例2∶1的條件下,酒精度可達10.6%vol，感官評分89，綜合分為1.094。在果酒發(fā)酵過程中采用復(fù)合菌發(fā)酵,由于不同菌株在發(fā)酵過程的物質(zhì)代謝過程中通過相互作用,互為補充,克服單一菌種發(fā)酵的果酒香味物質(zhì)不足,口味較為平淡得缺點,復(fù)合菌發(fā)酵的果酒中構(gòu)成果酒主體香氣的脂類物質(zhì)更豐富,其口感更加醇厚,香氣濃郁,提高果酒品質(zhì)。

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Effectofcomplexbacteriafermentationonwildkiwifruitwine

ZHANGJing1,ZUOYong1,*,XIEGuang-jie2,ZHANGXin1,SUNShi-guang1,QUJiao-jiao1

(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Sichuan Vocational College of Chemical Technology,Luzhou 646000,China)

Fermentation conditions of kiwi fruit wine fermented by complex bacteria were mainly studied in this paper. Temperature,SO2dosage,sugar content and proportion of complex bacteria were studied to wine quality. Through orthogonal test,the optimum fermenting conditions were determined as temperature 26 ℃,SO2dosage 80 mg/L,sugar content 210 g/L,proportion of complex bacteria 2∶1. Under these conditions,alcohol content in the wine could reach up to 10.6%vol and the flavors of wine were ideal. Volatile flavor compounds of kiwi fruit wine fermented respectively by complex bacteria and angel yeast were analysed by head space solid-phase micro extraction(HS-SPME)coupled to capillary gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). As a result,35 and 24 compounds were tested in two different wine and alcohols and lipids constituted the major aroma in kiwi fruit wine.

kiwi fruit wine;complex bacteria;fermentation;flavoring compositions

TS255.1

B

1002-0306(2017)19-0213-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.039

2017-02-21

張晶(1992-)，男，碩士，主要從事發(fā)酵食品方面的研究，E-mail：451298213@qq.com。

*通訊作者:左勇(1972-)，男，碩士，教授，主要從事發(fā)酵食品方面的研究，E-mail：sgzuoyong@tom.com。

四川省科技廳產(chǎn)業(yè)鏈項目(2016FZ0034)；四川省企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目(2015XM122)；四川理工學院研究生創(chuàng)新項目(Y2016011)；四川省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(201510622604)。