王俊鋼 李聰聰 毛廣顯 張 潔 楊 翠

(鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院/南陽(yáng)市中心醫(yī)院胸外科，南陽(yáng) 473000)

miR-210調(diào)控Mex3B蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和增殖的影響①

王俊鋼 李聰聰②毛廣顯③張 潔 楊 翠

(鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院/南陽(yáng)市中心醫(yī)院胸外科，南陽(yáng) 473000)

目的探討miR-210和Mex3B蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和增殖能力的影響。方法運(yùn)用qPCR檢測(cè)miR-210在正常肺組織和癌旁組織中的表達(dá)情況；運(yùn)用qPCR檢測(cè)Mex3B在肺癌組織、癌旁組織中的表達(dá)；qPCR檢測(cè)miR-210在不同肺癌細(xì)胞株中(A549、H1299、H1650和H358)的表達(dá)水平；雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-210對(duì)Mex3B轉(zhuǎn)錄的影響；細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞活性的影響；平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞A549的增殖能力的影響；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞株A549的侵襲能力的影響。結(jié)果和癌旁組織比較，miR-210在肺癌組織中表達(dá)明顯增高，和癌旁組織比較,Mex3B在肺癌中表達(dá)較低，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-210可以直接調(diào)控Mex3B的轉(zhuǎn)錄活性，抑制miR-210的表達(dá)活性后，A549肺癌細(xì)胞的細(xì)胞活性受到一定的抑制；抑制miR-210后，肺癌細(xì)胞株A549的侵襲和增殖能力明顯降低。結(jié)論miR-210可以靶向調(diào)控肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。

肺癌；miR-210；Mex3B；Transwell

肺癌是全世界呼吸系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是男性死亡率最高的惡性腫瘤，小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是其中主要的分類[2]。目前肺癌的主要治療方式包括手術(shù)，化療、放療，免疫治療及生物靶向治療等，盡管針對(duì)少部分肺癌亞型可以通過(guò)綜合治療獲得一定程度上的緩解，但是大部分類型的肺癌治療效果不佳或者緩解后容易復(fù)發(fā)，耐藥現(xiàn)象更是層出不窮，對(duì)疾病治療提出很多困難[3]。最近相關(guān)研究指出肺癌的復(fù)發(fā)、耐藥等生物學(xué)特性與某些分子指標(biāo)有相關(guān)關(guān)系[4]。盡管肺癌治療手段不斷進(jìn)步，但晚期肺癌患者的預(yù)后仍然很差，因此研發(fā)非侵入性且靈敏可靠的生物分子標(biāo)志物是目前亟需解決的問(wèn)題。

微小RNA(miRNA)是由18～22個(gè)核苷酸組成的小RNA編碼RNA[5]。已知這些小RNA分子在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。通過(guò)結(jié)合至特異性mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)，miRNA誘導(dǎo)降解或抑制靶mRNA的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。以往的研究表明，miRNAs在不同腫瘤中的表達(dá)明顯不同，在腫瘤相關(guān)基因組區(qū)中發(fā)現(xiàn)了有50%的已知miRNAs類型[7]。研究還表明miRNA和腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物之間存在密切的相關(guān)性[8]。

MiR-210在生物體中參與廣泛的生理病理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化、DNA修復(fù)和細(xì)胞代謝等[9,10]。而且miR-210在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)過(guò)程中起到主要的調(diào)節(jié)樞紐作用，尤其miR-210可以抑制線粒體正常代謝從而對(duì)許多蛋白電子傳遞鏈的活性產(chǎn)生一定影響[11,12]。miR-210對(duì)肺癌等腫瘤的代謝也有一定的影響，但具體機(jī)制未有報(bào)道。

Mex3最初是在早期胚胎發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的蛋白，其可以抑制部分蛋白翻譯過(guò)程，并且在對(duì)維持生殖系統(tǒng)的全能性中發(fā)揮重要作用[13]。在四種人類Mex3蛋白質(zhì)中，Mex3A主要在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用[14]。最近，據(jù)相關(guān)報(bào)道，Mex3B可以協(xié)調(diào)下游蛋白激活Rap1信號(hào)通路，進(jìn)而誘發(fā)小鼠后代的體重和外觀發(fā)生明顯的異常表現(xiàn)[15]。且有研究表明，過(guò)表達(dá)Mex3蛋白過(guò)后，結(jié)腸癌的生物學(xué)行為得到一定程度的抑制[16]。

本研究擬分析miR-210和Mex3B在肺癌中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討miR-210與Mex3B的相互作用以及其在肺癌的遷移增殖過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株及相關(guān)材料 肺癌細(xì)胞株A549、H1299、H1650和H358均源自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞培養(yǎng)條件：在RPMI1640培養(yǎng)基中加入1%青霉素/鏈霉素。用5%胎牛血清在5%CO2空氣濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。兔克隆單抗MEX3B購(gòu)于Abcam公司(Abcam，F(xiàn)LJ40270)。miR-210-inhibitor慢病毒載體購(gòu)買于上海吉瑪基因有限公司。SsoFast EvaGreen試劑及Lipofecta-mine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.2臨床標(biāo)本采集及處理 收集2015年3月～2016年7月我院收治的80例肺癌患者，其中年齡(54.24±3.61)歲。所有患者術(shù)前無(wú)化療或放療，根據(jù)肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)29例、Ⅱ級(jí)26例、Ⅲ級(jí)20例、Ⅳ級(jí)5例。低分化22例、中分化29例、高分化29例。腫瘤組織離體后分兩塊，一塊迅速投入RNA保存液中，另一塊用經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的冷磷酸緩沖液沖洗，去除血跡，迅速投入液氮凍存。標(biāo)本收集獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將miR-210-inhibitor和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后qPCR檢測(cè)miR-210的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Western印跡分析 提取A549肺癌細(xì)胞蛋白檢測(cè)Mex3B的表達(dá)水平。配置SDS-PAGE電泳膠，取免疫沉淀最后所得的上清，上樣，每孔30 μl，電泳。用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。電轉(zhuǎn)移完畢后，使用TBST洗滌1次。將膜放入5%牛奶封閉液于室溫封閉1 h，或4℃封閉過(guò)夜。用封閉液稀釋目標(biāo)蛋白抗體(Mex3B)1∶2 000，室溫下孵育作用2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。稀釋酶標(biāo)記二抗1∶500，室溫下孵育作用30 min。TBST洗膜3次，每次10 min。 使用Bio-Rad系統(tǒng)，ECL顯影劑顯影，使用Image Lab 3.0(Bio-Rad)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3PCR實(shí)驗(yàn)步驟 qPCR法檢測(cè)miR-210表達(dá)。將A549肺癌細(xì)胞接種于6孔板，接種密度為1×106L-1，培養(yǎng)36 h后按照Trizol說(shuō)明操作提取組細(xì)胞總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸的濃度和純度。用在SsoFast EvaGreen試劑(Bio-Rad)中以1∶10 稀釋的cDNA進(jìn)行qPCR測(cè)量。 將表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至相應(yīng)的參照基因。根據(jù)ΔΔCT 法計(jì)算檢測(cè)基因反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5min。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8(Dojindo Laboratories，Tokyo，Japan)評(píng)估細(xì)胞活力。將6×103的A549細(xì)胞種植于96孔板中，將10 μl的CCK-8溶液加入到各孔中，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育2 h(37℃和5%CO2)。 使用微板讀數(shù)器(Bio-Rad，CA，USA)在450 nm處測(cè)量吸光度，參考波長(zhǎng)為630 nm。 計(jì)算出細(xì)胞活性比率。

1.2.5平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞接種于6孔板，加入5 ml的無(wú)菌PBS溶液，輕輕吹散洗滌細(xì)胞沉淀并再次離心。反復(fù)洗滌3次后加入培養(yǎng)基，制備成單細(xì)胞懸液。測(cè)定細(xì)胞濃度并調(diào)整為1 000個(gè)/ml，將單細(xì)胞懸液均勻的種植在無(wú)菌的6孔板內(nèi)，進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。兩周后觀察平板克隆細(xì)胞形成情況，并拍照，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定肺癌細(xì)胞侵襲能力 使用Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行肺癌細(xì)胞侵襲能力測(cè)定。將總共5×104個(gè)細(xì)胞接種在無(wú)血清培養(yǎng)基中的上室中。底室含有10%FBS的培養(yǎng)基。 48 h后，棉球擦拭上室細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染色下室細(xì)胞。觀察并計(jì)數(shù)穿透Transwell膜的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 從人類基因組DNA產(chǎn)生全長(zhǎng)miR-210-3′UTR，并通過(guò)退火合成的信號(hào)寡核苷酸產(chǎn)生突變體miR-210-3′UTR。將這些DNA片段克隆到ph-TK載體(腎臟熒光素酶)中，Preporter-miR-Mex3B-3′UTR代表野生型質(zhì)粒載體和miR- Mex3B質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293U細(xì)胞內(nèi)，Preporter-miR-Mex3B-3′UTRm代表突變型質(zhì)粒載體和miR-Mex3B質(zhì)粒結(jié)合共轉(zhuǎn)染到293U細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)參照，檢測(cè)NC組和miR-210-inhibitor組293U細(xì)胞中Mex3B的熒光活性相對(duì)值。使用Lipofectamine2000TM(Invitrogen)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率在孢菌素酶活性的基礎(chǔ)上正常化。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒(Promega)測(cè)量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)miR-210對(duì)Mex3B 的表達(dá)活性的調(diào)控能力，明確miR-210對(duì)Mex3B熒光活性的調(diào)控情況。

2 結(jié)果

2.1qPCR檢測(cè)肺癌組織和不同肺癌細(xì)胞中miR-210的表達(dá) 通過(guò)使用qPCR測(cè)定miR-210在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示(圖1)：在不同肺癌細(xì)胞株中，miR-210在A549肺癌細(xì)胞株中表達(dá)相對(duì)較高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取A549細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。上述結(jié)果表明，miR-210在肺癌中可能充當(dāng)一個(gè)促癌分子的角色。

2.2Western blot檢測(cè)肺癌組織Mex3B的表達(dá)及miR-210與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 Western blot檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中Mex3B蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖2)：相比正常肺組織，肺癌組織中Mex3B表達(dá)水平相對(duì)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，Mex3B在肺癌中可能扮演一個(gè)相對(duì)抑癌的作用。

miR-210的表達(dá)水平隨肺癌病理分期的增加而降低；隨分化程度的降低，miR-210的表達(dá)水平逐漸降低；miR-210的低表達(dá)隨著淋巴結(jié)受累以及受累數(shù)目的增多而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-210的表達(dá)水平與年齡無(wú)關(guān)。結(jié)果表明(表1)：miR-210與肺癌病理分期分級(jí)以及淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與年齡等因素?zé)o關(guān)。

圖1 miR-210在不同肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-210 in lung cancer cell

圖2 Mex3B在肺癌組織中的表達(dá)情況Fig.2 Expression of Mex3B in lung cancerNote: *.P<0.05.

表1 miR-210表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210和Mex3B之間的關(guān)系Fig.3 Double luciferase assay to detect relationship betw-een miR-210 and Mex3BNote: A.miR-210-inhibitor inhibit the expression of miR-210;B.Double luciferase assay defect the relationship between miR-210 and Mex3B.*.P<0.05.

圖4 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210對(duì)A549細(xì)胞的影響Fig.4 Cell activity test were used to detect the effect of miR-210 on A549 cellsNote: *.P<0.05.

2.3雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210和Mex3B之間的關(guān)系 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞株中miR-210和Mex3B蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示(圖3)：加入miR-210-inhibitor后Mex3B的熒光活性水平出現(xiàn)相應(yīng)上調(diào)。表明miR-210可以調(diào)控Mex3B的表達(dá)水平。Mex3B是miR-210下游的一個(gè)靶點(diǎn)基因，miR-210可能通過(guò)干擾Mex3B的表達(dá)水平，繼而影響后續(xù)對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

2.4沉默miR-210表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測(cè)沉默miR-210對(duì)肺癌細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)：加入miR-21-inhibitor后細(xì)胞增殖活性受到明顯的抑制。

2.5沉默miR-210表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210對(duì)A549增殖能力的影響。使用miR-210-inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖能力。結(jié)果顯示(圖5)：相比NC組，miR-210-inhibitor組的克隆形成細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)相應(yīng)的減少[(220.32±18.15)% vs (42.28±8.16)%,P<0.05]。表明沉默miR-210的表達(dá)后可以明顯地抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖5 平板克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)沉默miR-210表達(dá)后A549細(xì)胞增殖能力的變化Fig.5 Proliferation of lung cancer cells were inhibited after inhibitor of miR-210Note: *.P<0.05.

2.6沉默miR-210表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-210的表達(dá)對(duì)A549侵襲能力的影響。使用miR-210-inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲測(cè)定。結(jié)果顯示(圖6)：相比NC組，miR-210-inhibitor組的細(xì)胞侵襲數(shù)目相應(yīng)減少[(330.32±25.82)% vs (65.37±11.34)%,P<0.05]。表明沉默miR-210的表達(dá)后可以明顯抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

目前臨床診斷肺癌的主要依據(jù)仍是病理細(xì)胞檢查，只有在病理細(xì)胞學(xué)確診肺癌后才可以臨床診斷，但是根據(jù)臨床癥狀及影像學(xué)早期診斷陽(yáng)性率較低[17]。因此,尋找一種早期診斷肺癌的方法極為迫切。RNA基因組和蛋白質(zhì)組指紋圖能夠整體定量、動(dòng)態(tài)反映疾病發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)的種類及其數(shù)量峰值變化規(guī)律，有助于尋找與疾病密切相關(guān)的蛋白，可以成為診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)記物及藥物治療的靶點(diǎn)[18]。近年來(lái)，RNA圖譜和蛋白組指紋圖在臨床疾病尤其是惡性腫瘤的診斷、預(yù)防及治療方面迅猛發(fā)展。所以尋求肺癌腫瘤的早期標(biāo)志物對(duì)于肺癌的臨床診斷和治療是極其重要的。

微小RNA(miRNA)可以調(diào)控基因的內(nèi)源性非編碼RNA，并且最近的研究已經(jīng)證明它們?cè)谀[瘤的發(fā)病機(jī)理中起到關(guān)鍵的作用[19]。miRNA表達(dá)譜可以作為診斷、預(yù)后、個(gè)體化治療和疾病管理的潛在生物標(biāo)志物[20]。目前，血清中循環(huán)miRNA可以以明顯穩(wěn)定的形式被鑒定出來(lái)，許多學(xué)者報(bào)道腫瘤患者血液中循環(huán)miRNA的異常表達(dá)。但是據(jù)我們所知，目前只有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者的血清或血漿miRNAs存在明顯異常[21]。然而，關(guān)于組織和血清血漿之間miRNA表達(dá)水平的關(guān)系仍有不同的爭(zhēng)議，尚未能在臨床檢測(cè)中達(dá)成一致[22]。

miR-210是由19～23個(gè)核苷酸組成，可以參與細(xì)胞內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié)[23]。最近有研究成功地建立了低溫細(xì)胞模型，通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)參與誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)[24]。然而，很多研究都是集中在將腫瘤細(xì)胞作為研究模型去探討在缺氧缺血性微環(huán)境中如何去避免過(guò)多凋亡的分子機(jī)制，沒(méi)有做關(guān)于miR-210對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的監(jiān)測(cè)和影響。萬(wàn)菁[25]研究表明，miR-210可以調(diào)控因基因缺失而導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能缺損對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，而且抑制miR-210的表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺氧缺血的耐受能力，間接地證明了miR-210的促癌機(jī)制。值得注意的是，抑制miR-210的表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡能力呈正相關(guān)。

而MiR-210也可以作為腫瘤的放射抗性標(biāo)記，miR-210在許多腫瘤中廣泛存在，尤其是肺癌的各個(gè)類型中，都存在miR-210的高表達(dá)狀態(tài)[26]。之前研究報(bào)道m(xù)iR-210可以作為小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[27]。更有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)術(shù)后放射治療的肺癌患者的miR-210的表達(dá)和DNA損傷修復(fù)之間有明顯的相關(guān)性，miR-210的表達(dá)可以影響DNA的損傷修復(fù)，從而導(dǎo)致肺癌的遠(yuǎn)處擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，甚至影響肺癌對(duì)化療藥物耐藥機(jī)制的產(chǎn)生[28]。

微小RNA可以參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程，其表達(dá)水平的缺失會(huì)影響轉(zhuǎn)錄平衡的穩(wěn)定[29]。有研究表明，抑制miR-210的表達(dá)可以大幅度降低卵巢癌、肺癌及前列腺癌細(xì)胞在裸鼠中的成瘤率，也可以改善荷瘤小鼠的預(yù)后[30]。我們實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肺癌組織和細(xì)胞中miR-210和Mex3B表達(dá)情況，確定miR-210在肺癌中扮演一個(gè)促癌基因的作用，然后查閱相關(guān)生物學(xué)信息，運(yùn)用Targetscans/PICTAR預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-210下游可能存在的靶基因位點(diǎn)，篩選出和肺癌有相關(guān)關(guān)系的靶基因。我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件查找，發(fā)現(xiàn)miR-210可能與Mex3B的某些保守序列相結(jié)合。因此我們推測(cè)Mex3B可能是miR-210的潛在下游靶基因，miR-210可能調(diào)控Mex3B的表達(dá)。為了進(jìn)一步探討肺癌細(xì)胞中miR-210的改變對(duì)Mex3B蛋白的影響，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-210-inhibitor到肺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)抑制miR-210能夠有效上調(diào)Mex3B蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果與其他腫瘤組織中Mex3B受miR-210的調(diào)控情況是相似的[31]。

通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者有相同結(jié)合位點(diǎn)，且miR-210可以調(diào)控Mex3B的表達(dá)。后面通過(guò)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默miR-210后肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化，證實(shí)miR-210可以調(diào)控肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。它提供了在功能學(xué)方面的miR-210和Mex3B之間的直接作用的證據(jù)。

總之，我們的研究表明miR-551和Mex3B在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用關(guān)系，更好地理解調(diào)控肺癌腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，可以對(duì)肺癌的臨床診療提供一定幫助，為肺癌的臨床診治提供新的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

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[收稿2017-03-24 修回2017-06-26]

(編輯 倪 鵬)

歡迎訂閱和投稿《中國(guó)免疫學(xué)雜志》

EffectsofmiR-210onMex3Bproteinonmigrationandproliferationoflungcancercells

WANGJun-Gang，LICong-Cong,MAOGuang-Xian,ZHANGJie,YANGCui.
DepartmentofThoracicSurgery,theAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityHospital/TheCentralHospitalofNanyangCity,Nanyang473000,China

Objective:To investigate the effect of miR-210 on the migration and proliferation of lung cancer cells.MethodsThe expression of miR-210 in normal lung tissues and lung cancer tissues were detected by qPCR.The expression of Mex3B in lung cancer tissues and adjacent tissues were detected by qPCR.qPCR was used to detect the expression of miR-210 in different lung cancer cell lines(A549,H1299,H1650 and H358).The effect of miR-210 on the transcription of Mex3B was detected by double luciferase reporter gene system.The effect of miR-210 expression on the activity of lung cancer cells was detected by cell viability assay.The effect of miR-210 on the proliferation of A549 cells were detected by plate cloning assay.Transwell invasion assay were used to detect the effect of miR-210 on the invasion ability of lung cancer cell line A549.ResultsCompared with adjacent tissues,the expression of miR-210 were significantly decreased in lung cancer tissues,Mex3B were lower in lung cancer.Double luciferase reporter gene system results showed that miR-210 can directly regulate the transcriptional activity of Mex3B.The invasion and proliferation ability of lung cancer cell line were significantly reduced after inhibition of miR-210.ConclusionmiR-210 can target regulate the expression of Mex3B,and affects the invasion and proliferation of lung cancer cells.

Lung cancer;miR-210;Mex3B;Transwell

①本文為深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140415162338820)和深圳市醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(201302068)。

②鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院/南陽(yáng)市中心醫(yī)院特需病房一病區(qū)，南陽(yáng) 473000。

③北京大學(xué)附屬深圳醫(yī)院胸外科，深圳 518036。

R734.2

A

1000-484X(2017)10-1468-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.006

王俊鋼(1978年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸外科疾病方面研究，E-mail：doctorll22@163.com。