李 慧 邢廣群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，青島 266555)

NETs刺激下慢性支氣管炎大鼠血清ANCA產(chǎn)生機(jī)制探討①

李 慧 邢廣群

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，青島 266555)

目的探討長(zhǎng)期慢性感染刺激誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)的機(jī)制。方法煙熏法聯(lián)合脂多糖氣管內(nèi)注入，建立慢性支氣管炎大鼠模型，用佛波脂(PMA)體外刺激大鼠中性粒細(xì)胞產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)絡(luò)(NETs)，以NETs免疫慢性支氣管炎大鼠，比較慢性支氣管炎NETs刺激組(CB/NETs)、慢性支氣管炎組(CB)和正常組三組大鼠血清髓過(guò)氧化物酶-抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(MPO-ANCA)、血清瓜氨酸化的組蛋白H3(CitH3)、血清IFN-α水平及血清肌酐、血清尿素氮、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白定量水平。結(jié)果(1)CB/NETs組的血清MPO-ANCA水平明顯高于CB組及正常組，(62.497 5±19.637 64)ng/ml vs(17.380 6±4.886 49)ng/ml，(20.888 4±4.396 07)ng/ml(P<0.01)。(2)CB/NETs組的血清CitH3水平明顯高于CB組及正常組，(32.597 4±20.291 5)ng/ml vs (8.856 8±2.366 92)ng/ml，(5.622 5±0.837 38)ng/ml，(P<0.05，P<0.01)。(3)CB/NETs組中有兩只大鼠的血清IFN-α水平異常升高(3 735.7、3 428.4 pg/ml)。(4)三組大鼠的腎臟相關(guān)指標(biāo)差異暫未呈現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)大鼠血清CitH3水平與血清MPO-ANCA水平呈正相關(guān)(r=0.61，P<0.05)。結(jié)論慢性支氣管炎長(zhǎng)期、反復(fù)感染可導(dǎo)致ANCA水平升高，從形成高水平的ANCA到最終形成ANCA相關(guān)性小血管炎尚需要時(shí)間。

小血管炎；感染；慢性支氣管炎；中性粒細(xì)胞保外網(wǎng)絡(luò)

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)相關(guān)性小血管炎(ANCA-associated vasculitides，AAV)是一組以小血管壁的炎癥和纖維素樣壞死為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其血清中存在針對(duì)靶抗原蛋白酶3(PR3)或髓過(guò)氧化物酶的ANCA[1]，主要包括肉芽腫型多血管炎、顯微鏡下型多血管炎、嗜酸細(xì)胞性肉芽腫型多血管炎。AAV的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，有研究報(bào)道63%的肉芽腫型多血管炎患者鼻腔中長(zhǎng)期攜帶金黃色葡萄球菌，與疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[2,3]，在維持治療期間接受復(fù)方新諾明抗菌治療可以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[4,5]。Kadowaki等[6]回顧性分析了國(guó)際上已報(bào)道的23例伴有長(zhǎng)期慢性肺部感染的AAV患者，在AAV發(fā)生之前，18例有長(zhǎng)期的慢性支氣管擴(kuò)張病史，3例有長(zhǎng)期的彌漫性泛性細(xì)支氣管炎病史，2例同時(shí)有慢性鼻竇炎及慢性支氣管炎病史。

中性粒細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)(Neutrophil Extracellular Traps，NETs)是機(jī)體在應(yīng)答細(xì)菌感染的過(guò)程中由中性粒細(xì)胞釋放的包含有核酸物質(zhì)與髓過(guò)氧化物酶、蛋白酶3、抗菌肽LL-37、彈性蛋白酶等多種顆粒蛋白組成的細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)[7]，因其可以捕獲和殺傷細(xì)菌，在感染性疾病發(fā)生時(shí)，可在感染部位或血清中檢測(cè)出NETs[8-10]。Nakazawa等[11]發(fā)現(xiàn)丙基硫氧嘧啶(Propylthiouracil，PTU)可導(dǎo)致NETs結(jié)構(gòu)異常，從而使NETs降解減少，激發(fā)形成MPO-ANCA，誘導(dǎo)ANCA相關(guān)性小血管炎發(fā)生；Kessenbrock 等以及我們的前期研究都發(fā)現(xiàn)在AAV患者的腎組織受損部位有NETs的沉積[12，13]。

在上述研究的基礎(chǔ)上，我們對(duì)2012年8月至2016年3月期間收治的42例AAV病人回顧性分析時(shí)竟發(fā)現(xiàn)有50%的病人在ANCA相關(guān)性小血管炎發(fā)病之前已有多年的慢性肺部疾病病史，其中10例為支氣管擴(kuò)張、11例為慢性支氣管炎，患慢性肺部疾病的時(shí)間平均為(18.33±15.8)年。進(jìn)一步提示長(zhǎng)期慢性感染與ANCA相關(guān)性小血管炎之間有密切聯(lián)系。因此，為進(jìn)一步探討慢性、反復(fù)感染、多次NETS刺激與ANCA相關(guān)性小血管炎之間的聯(lián)系，我們建立了慢性支氣管炎大鼠模型，給予NETs反復(fù)刺激，觀察大鼠的免疫學(xué)變化，檢測(cè)MPO-ANCA在此過(guò)程中形成的可能性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 脂多糖(LPS)、佛波脂(PMA)、弗氏佐劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Corning公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，抗瓜氨酸化的組蛋白H3抗體(ab5103)、抗MPO抗體(ab90810)均購(gòu)自Abcam公司，Alex Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG(bs-0295G-AF488)、Alex Fluor 647標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(bs-0296G-AF647)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAPI溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，大鼠髓過(guò)氧化物酶特異性抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(MPO-ANCA )ELISA Kit、大鼠瓜氨酸化的組蛋白H3(CitH3)ELISA Kit均購(gòu)自Neoscientific公司，大鼠IFN-α ELISA Kit購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體重180～200 g，購(gòu)自青島大任富城畜牧有限公司[scxkl(魯)20140007]，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度控制在20℃～25℃，濕度控制在40%～70%，自由進(jìn)食、進(jìn)水，12 h光照周期。

1.2方法

1.2.1建立慢性支氣管炎模型 初步將大鼠分為慢性支氣管炎組和正常組。慢性支氣管炎組于第1、15天給予氣管內(nèi)注入脂多糖，200 μg/只(1 mg/ml)，正常組給予氣管內(nèi)注入等體積PBS。慢性支氣管炎組大鼠于第2～14天、第16～28天每天在有機(jī)玻璃煙熏箱內(nèi)持續(xù)吸入哈德門(mén)香煙霧30 min，15支/次，2次/d，正常組不做處理。于第29天從2組中分別隨機(jī)處死2只大鼠，取肺組織固定、石蠟包埋，行HE染色驗(yàn)證慢性支氣管炎模型。

1.2.2提取大鼠中性粒細(xì)胞 大鼠腹腔提取中性粒細(xì)胞參照文獻(xiàn)[12]。向大鼠腹腔內(nèi)注射1 ml 4%的巰基乙酸鹽，巰基乙酸鹽可誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞到腹腔中。2 h后，向大鼠腹腔內(nèi)再次注射15 ml無(wú)菌PBS，后用空針回收，4℃，1 200 r/min 5 min離心，沉淀經(jīng)PBS洗2次，最后用含5%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)。

1.2.3誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs 24孔板內(nèi)預(yù)先置入多聚賴氨酸處理的細(xì)胞爬片，中性粒細(xì)胞按4×105個(gè)/ml接種至24孔板內(nèi)，每孔0.5 ml。用100 nmol/L PMA處理細(xì)胞，對(duì)照組給予等體積PBS，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.2.4NETs的免疫熒光染色 細(xì)胞爬片經(jīng)多聚甲醛固定、Triton X-100透膜、封閉液封閉后，用一抗(抗-H3Cit為1∶200，抗-MPO為1∶100)、二抗(濃度均為1∶200)進(jìn)行免疫熒光染色，DAPI復(fù)染核。封片后激光共聚焦顯微鏡成像。

1.2.5NETs提取及免疫大鼠 將大鼠分為慢性支氣管炎NETs刺激組(CB/NETs)、慢性支氣管炎組(CB)、正常組。中性粒細(xì)胞按1×107個(gè)/瓶接種至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用100 nmol/L PMA處理細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，后收集瓶?jī)?nèi)所有物，4℃ 1 200 r/min 10 min離心，取沉淀溶于0.25 ml PBS，與等體積的弗氏佐劑混合，于第0、7、14、21天給予CB/NETs組大鼠皮下注射，其中第1次與完全弗氏佐劑混合，第2、3、4次與不完全弗氏佐劑混合。慢性支氣管炎組及正常組給予注射等體積的PBS。于第28天留取血、尿后處死大鼠。

1.2.6標(biāo)本采集 經(jīng)代謝籠留取24 h尿液，檢測(cè)尿常規(guī)和24 h尿蛋白定量，或于-80℃凍存?zhèn)溆?；?jīng)眼眥靜脈留取血標(biāo)本，血標(biāo)本經(jīng)4℃ 3 000 r/min 10 min離心后取上清，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7血、尿標(biāo)本的檢測(cè) 血清MPO-ANCA、瓜氨酸化的組蛋白H3的檢測(cè)采用競(jìng)爭(zhēng)法，IFN-α的檢測(cè)采用雙抗夾心法。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定OD值。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)指標(biāo)的濃度。腎功、尿常規(guī)和24小時(shí)尿蛋白定量于青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科。

2 結(jié)果

2.1慢性支氣管炎大鼠肺臟的病理變化 慢性支氣管炎大鼠的肺部HE染色可見(jiàn)氣管及支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞部分壞死、脫落，纖毛變短，參差不齊；支氣管黏液腺體增生、黏液細(xì)胞分泌增多；肌層可見(jiàn)各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血、水腫和纖維增生，局部管壁塌陷、扭曲變形或擴(kuò)張(圖1)。

圖1 慢性支氣管炎大鼠肺組織HE染色(×20)Fig.1 Lung HE staining of chronic bronchitis rat(×20)

圖2 NETs激光共聚焦顯微成像(×40)Fig.2 Confocal laser scanning microscopy image of NETs(×40)

2.2免疫熒光染色鑒定NETs 激光共聚焦顯微鏡下，中性粒細(xì)胞在接受PMA刺激4 h后，產(chǎn)生大量細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由DNA、瓜氨酸化組蛋白H3及MPO等組成，從顯微結(jié)構(gòu)和組成成分上可鑒定為NETs(圖2)。

2.3三組大鼠血清中MPO-ANCA水平的比較 CB/NETs組的血清MPO-ANCA水平為(62.497 5±19.637 64)ng/ml，而CB組的血清MPO-ANCA水平為(17.380 6±4.886 49)ng/ml，正常組的血清MPO-ANCA水平為(20.888 4±4.396 07)ng/ml，CB/NETs組血清MPO-ANCA水平明顯高于CB組及正常組(圖3)。

2.4三組大鼠瓜氨酸化組蛋白H3(CitH3)水平 CB/NETs組血清CitH3水平為(32.597 4±20.291 5) ng/ml，而CB組的血清CitH3水平為 (8.856 8±2.366 92)ng/ml，正常組的血清CitH3水平為(5.622 5±0.837 38)ng/ml CB/NETs組血清CitH3水平明顯高于CB組及正常組(圖4)。

圖3 三組大鼠的血清MPO-ANCA水平Fig.3 Level of serum MPO-ANCA among groupsNote: *.P<0.01.

圖4 三組大鼠的血清CitH3水平Fig.4 Level of serum CitH3 among groupsNote: *.P<0.01.

表1 腎臟相關(guān)指標(biāo)的比較

圖5 大鼠血清CitH3水平與血清MPO-ANCA水平相關(guān)性分析Fig.5 Relationship between serum MPO-ANCA with CitH3

2.5三組大鼠的血清IFN-α水平 CB/NETs組(n=6)的血清IFN-α水平與CB組(n=5)及正常組(n=4)相比，32.5(3 476.93)pg/ml、34(5.5)pg/ml、30(16.5)pg/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但CB/NETs組中有兩只大鼠的血清IFN-α水平是明顯升高的(3 735.7、3 428.4 pg/ml)。

2.6三組大鼠的腎臟評(píng)估結(jié)果 比較三組大鼠的血清肌酐、血清尿素氮、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、24小時(shí)尿蛋白定量水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表1)。

2.7相關(guān)性分析 大鼠血清CitH3水平與血清MPO-ANCA水平呈正相關(guān)(P<0.05，圖5)。

3 討論

AAV是一種累及全身多個(gè)器官的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，ANCA被認(rèn)為是診斷和監(jiān)測(cè)AAV活動(dòng)的一個(gè)重要的指標(biāo)[14]。ANCA在ANCA相關(guān)性小血管炎中的致病性早已有明確的證據(jù)[15,16]。所以ANCA產(chǎn)生的源頭性研究對(duì)探討血管炎的發(fā)病機(jī)制具有重大意義。

有研究報(bào)道ANCA可存在于感染性心內(nèi)膜炎、慢性丙型肝炎、肺結(jié)核等慢性感染性疾病中[17-20]，這表明ANCA的產(chǎn)生與感染相關(guān)。慢性支氣管炎是氣管、支氣管黏膜及周圍組織的慢性非特異性炎癥，常伴隨長(zhǎng)期反復(fù)的肺部感染。Kobayashi等[21]報(bào)道在革蘭陰性桿菌引起慢性肺部感染的患者中，可檢測(cè)到殺菌/通透性蛋白(BPI)相關(guān)的ANCA。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在合并慢性支氣管炎的AAV患者中，肽酰基精氨酸脫亞胺酶 4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4)，NETs合成必需的酶，明顯高于無(wú)血管炎的慢性支氣管炎患者及健康人群[22]。我們對(duì)收治的AAV病人分析發(fā)現(xiàn)有50%的病人在ANCA相關(guān)性小血管炎發(fā)病之前已有多年的慢性肺部疾病病史，推測(cè)機(jī)體在反復(fù)、多次抗感染應(yīng)答的過(guò)程中，釋放大量NETs來(lái)捕獲和殺傷細(xì)菌，在此過(guò)程中NETs中的顆粒抗原成分反復(fù)多次暴露，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起免疫應(yīng)答，最終產(chǎn)生相應(yīng)的抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)。

目前已有研究通過(guò)給予相應(yīng)的抗原刺激，成功建立了AAV的動(dòng)物模型。Little等[23]通過(guò)用人MPO免疫M(jìn)PO-ANCA基因敲除的大鼠，使大鼠產(chǎn)生MPO-ANCA，將其注入野生型大鼠體內(nèi)，制造出同時(shí)累及了肺臟、腎臟的大鼠AAV模型；Yong等[24]用細(xì)菌的PR3同源蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了PR3-ANCA。本研究中，我們首先建立起慢性支氣管炎大鼠模型，再用PMA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs，用NETs聯(lián)合弗氏佐劑反復(fù)多次免疫慢性支氣管炎大鼠。在給予大鼠NETs刺激4次后檢測(cè)大鼠血清MPO-ANCA水平，結(jié)果表明CB/NETs組血清MPO-ANCA水平較CB組及正常組明顯升高。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)NETs的標(biāo)志蛋白——瓜氨酸化的組蛋白H3(CitH3)來(lái)評(píng)估大鼠血清中NETs的水平，發(fā)現(xiàn)CB/NETs組血清CitH3水平較CB組及正常組明顯升高，且血清CitH3升高水平與血清MPO-ANCA水平呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明NETs參與了誘導(dǎo)ANCA的產(chǎn)生。ANCA可與促炎癥因子激活的中性粒細(xì)胞表面的MPO結(jié)合，導(dǎo)致更多中性粒細(xì)胞激活，釋放更多NETs，從而形成了NETs與ANCA之間的惡性循環(huán)[25]。NETs中含有抗菌肽LL-37，是中性粒細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性殺菌肽，可通過(guò)Toll樣受體9(Toll like receptor-9，TLR-9)將自身DNA轉(zhuǎn)換為能夠激活漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoiddendritic cells，pDC)的刺激性配體，刺激pDC產(chǎn)生IFN-α，IFN-α 亦可刺激中性粒細(xì)胞進(jìn)一步釋放NETs[26，27]。我們的前期研究證實(shí)在AAV患者血清中IFN-α的水平明顯增高[28]。本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)俅伪容^了三組大鼠血清中IFN-α水平，發(fā)現(xiàn)CB/NETs組中有兩只大鼠的血清IFN-α水平(3 735.7、3 428.4 pg/ml)與其他兩組相比異常升高。提示在感染及NETs刺激下，這兩只大鼠已發(fā)生了明顯的免疫學(xué)異常，也進(jìn)一步解釋了CB/NETs組血清MPO-ANCA水平較CB組及正常組明顯升高的原因。

遺憾的是在本研究中慢性支氣管炎NETs組大鼠的腎功能、尿液分析、24小時(shí)尿蛋白定量暫時(shí)未見(jiàn)出現(xiàn)明顯異常，分析可能與以下原因有關(guān)：①NETs獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)可引起血管炎，促進(jìn)血栓形成，使用DNase處理NETs后因降解了其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而可阻止血栓形成[29]。在本研究以NETs聯(lián)合弗氏佐劑免疫大鼠，是發(fā)揮NETs中的抗原成分的免疫原性。NETs與弗氏佐劑混合過(guò)程中，NETs的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)已被破壞而失去其直接致病性。②慢性支氣管炎發(fā)展成AAV需較長(zhǎng)的時(shí)間，且在整個(gè)病程中常伴有反復(fù)多次感染，而本實(shí)驗(yàn)在模擬過(guò)程中，僅給予大鼠4次NETs刺激，刺激時(shí)間較短，ANCA水平剛剛升高，還不足以導(dǎo)致器官損害。如想進(jìn)一步觀察器官損害，預(yù)計(jì)需要繼續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間給予刺激。但本研究中，在慢支模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)四次刺激后，因擔(dān)心大鼠死亡而未無(wú)限地延長(zhǎng)觀察與刺激時(shí)間。

綜上，我們推測(cè)慢性支氣管炎反復(fù)感染過(guò)程中可釋放大量NETs，其內(nèi)含有的MPO抗原等反復(fù)多次暴露，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體。

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[收稿2017-04-19 修回2017-06-28]

(編輯 許四平 劉格格)

NeutrophilextracellulartrapsinduceproductionofMPO-ANCAinchronicbronchitisrats

LIHui,XINGGuang-Qun.
DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266555,China

Objective:To investigate the mechanism of chronic bronchitis with recurrent long duration infections in the production of MPO anti-neutrophil cytoplasmic antibodies(ANCA).MethodsRats were gave intratracheal injection of LPS and smoked to established chronic bronchitis(CB)model.Rat neutrophils were incubated with phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)to induce Neutrophil extracellular traps(NETs).NETs were then used to immune chronic bronchitis rats.Serum concentrations of myeloperoxidase anti-neutrophil cytoplasmic antibodies(MPO-ANCA),Citrullinated Histone H3(CitH3),Interferon-α(IFN-α)were evaluated.Results(1)The serum levels of MPO-ANCA in chronic bronchitis rats immuned with NETs(CB/NETs)were significantly higher than those in chronic bronchitis rats(CB)and healthy control rats,(62.497 5±19.637 64)ng/ml vs (17.380 6±4.886 49)ng/ml,(20.888 4±4.396 07)ng/ml(bothP<0.01).(2)The serum levels of CitH3 in CB/NETs rat were significantly higher than those in CB rat and healthy control rats,(32.597 4±20.291 5)ng/ml vs (8.856 8±2.366 92)ng/ml,(5.622 5±0.837 38)ng/ml(P<0.05，P<0.01).(3)The serum levels of IFN-α were found increased sharply in two CB/NETs rats(3 735.7,3 428.4 pg/ml).(4)Renal function among three groups showed no significant difference yet.(5)Serum CitH3 level showed a positive correlation with serum MPO-ANCA level(r=0.61，P<0.05).ConclusionChronic bronchitis with recurrent infections could induce the production of ANCA probably by the stimulation of NETs,but whether it might develop to AAV remains need a duration.

Small vessel vasculitis;Infection;Chronic bronchitis;Neutrophil extracellular Traps

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(縱向：81770699)、山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014WS0176)和青島市科技局成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃科技惠民專項(xiàng)(縱向：15-9-2-90-nsh)資助。

R593.2

A

1000-484X(2017)10-1458-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.004

李 慧(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事自身免疫性腎病方面的研究，E-mail:13954495475@163.com。

及指導(dǎo)教師：邢廣群(1970年-)，女，博士，教授，主任，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫性腎病方面的研究，E-mail:gqx99monash@163.com。