孫云暉 王一新 馬雪梅 章 婷 趙艷景

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，佳木斯 154003)

IL-37抑制IL-18在大鼠肺纖維化模型中的表達及意義的探討①

孫云暉 王一新 馬雪梅 章 婷 趙艷景

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，佳木斯 154003)

目的初步研究博來霉素致肺纖維化大鼠肺組織中IL-37、IL-18的表達水平，探討其在PF發(fā)生、發(fā)展中的表達及意義。方法將45只清潔級Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法分為健康對照組(N組)、博來霉素組(B組)、地塞米松治療組(D組)，每組大鼠各15只，B組及D組大鼠給予氣管內(nèi)注射博來霉素4 mg/kg制作肺纖維化模型，N組給予相同體積生理鹽水作為對照，D組大鼠于肺纖維化造?；A(chǔ)上第2天每日腹腔注射地塞米3 mg/kg，N、B組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。各組大鼠分別于造模后第7、14、28天處死，HE染色評價肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，堿水解法及酶聯(lián)免疫吸附法分別測定肺組織勻漿中羥脯氨酸(HYP)、IL-37含量，RT-PCR法測定肺組織中IL-18mRNA表達量。結(jié)果①HE染色顯示B、D組大鼠肺組織病理學(xué)改變由肺泡炎癥逐漸發(fā)展為纖維化，B、D組HYP含量隨時間推移逐漸升高，以第28天為著(P<0.05)；②B、D組IL-37、IL-18mRNA表達于第7天升高至最高點，后逐漸降低，至第28天均高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；③D組IL-37、IL-18mRNA表達在同一時間均低于B組(P<0.05)。結(jié)論IL-37、IL-18在大鼠肺纖維化發(fā)病早期起重要作用，可能參與了肺纖維化發(fā)生與發(fā)展。

肺纖維化；IL-37；IL-18；博來霉素

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是一種原因不明的慢性間質(zhì)性肺部疾病，其病理主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracell-ular matrix，ECM)大量沉積等[1]。有研究報道肺纖維化是由肺組織受到損傷后，修復(fù)調(diào)節(jié)失控及重建異常引起的病理改變，是一系列細(xì)胞因子、炎性因子、生長因子等通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果[2]。IL-37是IL-1家族新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，有研究報道IL-37可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)先天性及固有免疫應(yīng)答，抑制促炎細(xì)胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生和對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[3]。IL-18通過調(diào)控多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進炎癥發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞因子生成等作用[4]。本實驗建立博來霉素致大鼠肺纖維化模型，探討IL-37/IL-18軸在其發(fā)病中的作用及意義，可為闡明這類疾病發(fā)病機制及治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級Wistar大鼠45只(雌雄各半)，6周齡，體重180～220 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供[許可證號：SCXK(黑)2013-001]，隨機分為健康對照組(N組)、博來霉素組(B組)和地塞米松治療組(D組)，每組各15只大鼠，于佳木斯大學(xué)動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2實驗材料與試劑 注射用鹽酸博來霉素BLM(海正輝瑞制藥有限公司提供)；HE染色試劑(湖北錦源醫(yī)療科技有限公司提供)；Nikon eclipse 50i顯微鏡(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司提供)；IL-37大鼠ELISA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供)；大鼠HYP試劑盒(上海勁馬實驗設(shè)備有限公司提供)；RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立及標(biāo)本留取 B、D組以4 mg/kg劑量博來霉素一次性快速推注至氣管內(nèi)，N組給予等體積生理鹽水。D組大鼠于肺纖維化造?；A(chǔ)上第2日開始每日腹腔注射地塞米松3 mg/kg；N、B組大鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。各組大鼠造模后分別于第7、14、28天處死，取右上肺組織置于10%甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片，HE染色，觀察肺組織結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)學(xué)變化；從左肺組織上留取50 mg肺組織，制備組織勻漿，用于HYP、IL-37檢測；取右肺組織100 mg，放入Eppendorf 管內(nèi)，-80℃保存，用于檢測IL-18mRNA表達水平。

1.2.2ELISA方法 堿水解法測定肺組織HYP含量，ELISA法檢測肺組織IL-37表達水平，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3RT-PCR檢測肺組織IL-18mRNA表達水平 提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的基因IL-18mRNA上游引物：5′-GAGGACTGGCTGTG-ACCCTATC-3′，下游引物5′-CCTGGCACACGT-TTCTGAAA-3′，擴增片段151 bp。內(nèi)參照 β-actin mRNA 上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增片段150 bp。PCR反應(yīng)條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)HE染色結(jié)果 N組大鼠肺組織氣道上皮光滑，無炎性細(xì)胞滲出，無纖維化形成。B、D組大鼠第7天肺組織沿支氣管、肺組織炎性細(xì)胞滲出浸潤，累及肺泡氣管周圍；第14天肺組織、氣管、動脈周圍炎細(xì)胞滲出較前略減少，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，成纖維細(xì)胞增生；第28天肺組織大量結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔明顯增寬，肺組織呈明顯纖維化改變，B組與D組比較，纖維化程度加重。見圖1。

2.2大鼠肺組織HYP含量變化 與N組比較，B、D組大鼠肺組織勻漿中HYP含量于造模后第7天明顯升高，第28天達高峰，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3ELISA法檢測肺組織IL-37水平 B、D組IL-37含量于第7天達高峰，后逐漸降低，第28天仍高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4大鼠肺組織中IL-18mRNA表達水平 隨著時間進展B、D組肺組織IL-18mRNA表達量第7天達高峰，后逐漸下降，第28天仍高于N組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖2。

圖1 肺組織HE染色病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes of lung tissue with HE staining

表1 實驗大鼠肺組織羥脯氨酸含量(μg/mg)

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

表2 IL-37在各組大鼠肺組織中含量比較(pg/ml)

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

表3 IL-18mRNA在各組大鼠肺組織中表達水平

Note：Compared with group N,1)P<0.05.

圖2 IL-18mRNA擴增圖Fig.2 IL-18mRNA amplification map

3 討論

本實驗建立大鼠肺纖維化模型，采用當(dāng)前國內(nèi)外公認(rèn)并廣泛應(yīng)用的氣管內(nèi)注入博來霉素的實驗方法[5]，因HYP含量可以反映機體膠原代謝情況，故測定組織中HYP含量，可以反映肺纖維化嚴(yán)重程度[6]。此次實驗一次性快速氣管內(nèi)推注博來霉素4 mg/kg 后，大鼠肺組織病理由初期的肺泡炎階段發(fā)展為后期的肺纖維化性變。B組、D組HYP含量隨時間進展逐漸升高，第28天達高峰，這與Huang等[7]報道一致,提示肺纖維化動物模型制作成功。

目前，細(xì)胞因子參與肺纖維化過程中的機制研究逐漸成為熱點，有學(xué)者認(rèn)為造成肺纖維化的基礎(chǔ)是細(xì)胞因子的調(diào)控失衡作用。但近年來，大量動物實驗證明起關(guān)鍵作用的可能不是Th1/Th2型細(xì)胞因子[8，9]。

為探討IL-37及IL-18在肺纖維化中的表達及意義，實驗采用ELISA法測定肺組織勻漿中IL-37含量，RT-PCR法檢測IL-18在大鼠肺纖維化模型中的動態(tài)表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B組、D組中IL-37、IL-18表達在不同時間點均高于N組(P<0.05)，尤其在第7天肺泡炎階段，IL-37含量及IL-18mRNA表達達高峰。B組中IL-18mRNA表達于第7天至高峰，后逐漸下降，第28天仍高于N組，這與文獻[10]報道相一致。提示IL-37、IL-18可能與肺纖維化形成過程中的炎癥損傷及纖維化形成密切相關(guān)。其可能的機制為：IL-37作為抑炎因子，阻斷Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制磷酸化STAT1-4的活性、下調(diào)樹突狀細(xì)胞(DC)，抑制早期促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-ɑ等表達[11]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-37能與IL-18BP結(jié)合形成復(fù)合物而抑制IL-18的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制促炎因子表達，下調(diào)炎癥應(yīng)答反應(yīng)[12]。Nold等[13]用抑制物SIS3阻斷Smad3后發(fā)現(xiàn)，IL-37對炎癥因子表達的抑制效應(yīng)被阻斷，提示IL-37可通過抑制Smad3表達而抑制肺纖維化的發(fā)展。IL-18可促進IL-9、IL-13、TNF-ɑ及GM-CSF等的表達[14]；誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附因子ICAM-1的表達而促進炎細(xì)胞募集，上調(diào)NF-κB的表達和活性，它參與肺纖維化模型早期肺損傷階段，并與調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達有關(guān)[15]。另外，IL-18作用于NK細(xì)胞時，上調(diào)FasL的表達，增強對陽性靶細(xì)胞的毒性，F(xiàn)as-FasL介導(dǎo)的支氣管和肺泡上皮細(xì)胞的凋亡也參與博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[16，17]。故我們認(rèn)為IL-18可能是肺纖維化中重要的炎癥因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達參與和維持炎癥發(fā)生、發(fā)展，并因此參與早期肺損傷。本實驗中，B、D組IL-37、IL-18的表達均于第7天達高峰，后逐漸下降，提示兩者參與肺纖維化早期肺泡炎癥反應(yīng)階段，IL-18高水平表達反饋性促進IL-37表達上調(diào)，從而下調(diào)炎癥反應(yīng)，保護機體免受炎癥損害。體外研究證實，IL-18等炎癥因子可以誘導(dǎo)IL-37合成，二者在相關(guān)疾病的免疫調(diào)節(jié)中，發(fā)揮著相輔相成的炎癥激發(fā)和抑制作用[18]。推測，IL-37和IL-18在大鼠肺纖維化早期肺泡炎癥階段發(fā)揮重要作用，可能參與了肺纖維化發(fā)生與發(fā)展。

本實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用地塞米松治療的D組IL-37、IL-18表達水平及變化趨勢與B組相一致，表達水平同時間低于B組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。可能的作用機制為：地塞米松是一種強效的免疫抑制劑，一定程度上抑制多種細(xì)胞因子的合成和分泌，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞功能及降低免疫復(fù)合物表達水平，減輕IPF的肺泡炎和纖維化[19]。本研究提示，地塞米松可通過抑制IL-18的表達，從而減少細(xì)胞因子表達，減輕炎癥反應(yīng)，抑制肺纖維化進展。

本實驗在動物水平探討了關(guān)于IL-37、IL-18在肺纖維化中的作用和機制。實驗動物和人類發(fā)病機制基本相同，但仍存在差異，應(yīng)進一步進行臨床實驗研究，為纖維化的治療提供依據(jù)。

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[收稿2017-05-04 修回2017-05-25]

(編輯 倪 鵬)

ExpressionandsignificancediscussionofIL-37inhibitsIL-18inratpulmonaryfibrosismodels

SUNYun-Hui,WANGYi-Xin,MAXue-Mei,ZHANGTing,ZHAOYan-Jing.
TheFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，Jiamusi154003，China

Objective:To investigate the expression of IL-37 and IL-18 in the lung tissue of rats with bleomycin induced pulmonary fibrosis,and to explore the expression and significance of PF in the lung.Methods45 Sprague Wistar rats were randomly divided into normal control group(N Group),bleomycin group(B group),dexamethasone group(D group),15 rats in each group.B group and D group rats were given intratracheal injection of bleomycin 4 mg/kg，pulmonary fibrosis model was made,N group was given the same volume of normal saline as control group D,rats in pulmonary fibrosis model based on second days of daily intraperitoneal injection of dexamethasone 3 mg/kg；N,B group rats were intraperitoneally injected with normal saline as control.The rats were sacrificed after modeling 7,14,28 days,HE staining was used to evaluate the lung tissue pathological changes；hydroxyproline in lung tissue was measured by alkali hydrolysis and enzyme linked immunosorbent assay(HYP),the content of IL-37,the determination of expression of IL-18mRNA in lung tissue by RT-PCR.Results①HE staining showed that B,D group of rat lung tissue pathological changes by alveolar inflammation gradually developed into liver fibrosis；B,D group HYP content increased gradually with the elapse of time,for 28 days(P<0.05).②B,D group IL-37,the expression of IL-18mRNA on the seventh day increased to the highest point.After gradually reduced，to 28 days were higher than N group,the difference was statistically significant(P<0.05).③The expression of IL-37 and IL-18mRNA in group D was lower than that in group B at the same time(P<0.05).ConclusionIL-37,IL-18 play an important role in the early stage of pulmonary fibrosis in rats,and may be involved in the occurrence and development of pulmonary fibrosis.

Pulmonary fibrosis； IL-37； IL-18；Bleomycin

①本文為佳木斯大學(xué)校級面上項目(JMSUJCMS2016-049)和佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目醫(yī)藥類重點項目(YZ2016-019)。

R392.12

A

1000-484X(2017)10-1464-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.005

孫云暉(1970年-)，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺間質(zhì)纖維化及慢阻肺方面的研究，E-mail：394849603@qq.com。