朱 娜 劉雪麗 仇 妮 張潔婷 吳詩(shī)品 李體遠(yuǎn) 郭 焱 李 昌 金寧一

(青島市中心醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266042)

·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

HIV-1假病毒感染未成熟樹突狀細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究①

朱 娜 劉雪麗 仇 妮 張潔婷 吳詩(shī)品②李體遠(yuǎn)②郭 焱③李 昌④金寧一④

(青島市中心醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266042)

目的構(gòu)建攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的HIV-1假病毒；通過HIV-1假病毒感染未成熟樹突狀細(xì)胞(immatural dendritic cell,iDC)實(shí)驗(yàn)探討病毒與細(xì)胞的相互作用。方法利用慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建攜帶EGFP基因的HIV-1假病毒，通過RT-PCR擴(kuò)增HIV-1假病毒中的EGFP基因；HIV-1假病毒感染iDC，對(duì)HIV-1假病毒感染iDC后的基因組整合和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，觀察被感染iDC中EGFP基因的表達(dá)。結(jié)果構(gòu)建的HIV-1假病毒通過RT-PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增得到EGFP基因；HIV-1假病毒感染iDC后，在基因組整合和轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)中都擴(kuò)增得到了EGFP基因，熒光顯微鏡觀察被HIV-1假病毒感染的iDC，觀察到iDC表達(dá)綠色熒光蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶EGFP基因的HIV-1假病毒；HIV-1假病毒可以感染iDC，并將其遺傳物質(zhì)整合到iDC基因組中，并經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯使iDC表達(dá)EGFP。

HIV-1假病毒；未成熟樹突狀細(xì)胞；感染實(shí)驗(yàn)

艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)由人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起，HIV-1為主要病原，是循環(huán)CD4+T淋巴細(xì)胞顯著下降、機(jī)會(huì)感染及惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜合征[1]。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)是目前已知功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presentation cell,APC)，主要誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)，是抗感染免疫的中心環(huán)節(jié)。一般認(rèn)為HIV-1侵入人體后，首先感染DC，DC將病毒抗原進(jìn)行處理，提呈給T淋巴細(xì)胞，進(jìn)而激發(fā)一系列抗病毒免疫反應(yīng)[2,3]，DC在HIV感染與免疫中起到重要作用。DC家族的特點(diǎn)之一是成熟過程，在這個(gè)過程期間，他們改變形態(tài)和功能[4]。iDC有細(xì)胞吞噬能力，在受傷或感染部位捕獲抗原，DC吞噬過程比其他吞噬細(xì)胞更為復(fù)雜，并在MHCⅠ、Ⅱ類分子上呈遞正確的抗原蛋白[5]，加工抗原之后，DC成熟，轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)，吞噬功能下降和抗原遞呈能力提升，并進(jìn)一步導(dǎo)致T細(xì)胞的激活。因此，本文選擇抗原吞噬功能較強(qiáng)的iDC作為靶細(xì)胞對(duì)HIV-1病毒感染機(jī)制進(jìn)行研究，且既往關(guān)于HIV-1病毒此類感染的機(jī)制研究和相關(guān)報(bào)道寥寥無幾。

由于直接操作HIV-1存在生物安全性問題，需要在生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，所以構(gòu)建假病毒是當(dāng)前HIV-1研究的一個(gè)重要手段。假病毒核酸分子上編碼囊膜蛋白的基因被修飾掉，喪失了病毒的自我復(fù)制能力，只進(jìn)行“一個(gè)細(xì)胞周期”的侵染，具有單輪感染活性，因此不需要在高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室操作[6]。我們選用質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)構(gòu)建HIV-1假病毒，pNL4-3-ΔE-EGFP為骨架質(zhì)粒，是基于HIV-1原病毒的克隆pNL4-3，但在env開放閱讀框中用EGFP基因替代，pTHRO4156 clone 18(SVPB15)為外膜蛋白包裝質(zhì)粒，來自B型病毒，含有全長(zhǎng)env和rev基因，這兩種質(zhì)粒經(jīng)過細(xì)胞共轉(zhuǎn)染可以包裝出HIV-1假病毒。筆者課題組已經(jīng)建立4 d獲得具有典型形態(tài)、表型和功能iDC的優(yōu)化方法[7]。HIV-1為反轉(zhuǎn)錄病毒，感染靶細(xì)胞后可以將自身遺傳物質(zhì)整合到靶細(xì)胞基因組中，表達(dá)相應(yīng)的蛋白。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，擬以構(gòu)建成功的HIV-1假病毒感染iDC，病毒內(nèi)化后，其RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄會(huì)整合到iDC基因組中，同時(shí)HIV-1假病毒攜帶的EGFP基因在iDC中經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯最后表達(dá)EGFP，針對(duì)HIV-1假病毒這一生物學(xué)特性我們可以對(duì)病毒感染及病毒與細(xì)胞相互作用進(jìn)行探討，對(duì)HIV感染DC的研究進(jìn)行了有益的嘗試。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人胚胎腎細(xì)胞系293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；iDC為本課題組通過免疫磁珠技術(shù)分離與體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得。

1.1.2菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌E.coli STBL 2購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司；HIV-1假病毒骨架質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP和外膜蛋白包裝質(zhì)粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒研究所馮霞博士惠贈(zèng)。

1.1.3工具酶、主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ、DL 2000 DNA標(biāo)志物、λEcoT14 IDNA標(biāo)志物、rTaq酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、dNTP和RNasin抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；氨芐青霉素購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒制備試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN；0.25%胰蛋白酶(1×)溶液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；opti-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；FuGEENE HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；EGFP上下游引物和DEPC水購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他常規(guī)生物化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。高速常溫離心機(jī)(Sigma)；高速低溫臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf)；-80℃超低溫冰箱(三洋公司)；熒光顯微鏡(Olympus)；倒置顯微鏡(XSZ-D2)(重慶光學(xué)儀器廠)；透射電鏡(JEM-1200 EXⅡ)(日本電子公司)。

1.2方法

1.2.1pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)質(zhì)粒大量制備及濃度測(cè)定 制備假病毒包裝系統(tǒng)配套大腸桿菌STBL 2感受態(tài)細(xì)胞參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行的操作[8]，將質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)用STBL 2感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切反應(yīng)鑒定pNL4-3-ΔE-EGFP，利用HindⅢ和BamHⅠ雙酶酶切反應(yīng)鑒定pTHRO4156 clone 18(SVPB15)，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用分光光度計(jì)NANODROP 2000測(cè)定質(zhì)粒濃度。

1.2.2HIV-1假病毒包裝及保存 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞按照5×106～6×106cells/ml的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)液為正常含有10% FBS的DMEM，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h；在0.5 ml無抗生素?zé)o血清的opti-MEM中加入3 μg質(zhì)粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)和9 μg質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP，輕彈混勻，室溫放置孵育5 min，加入40 μl Fugene HD輕彈混勻，室溫放置孵育20 min制成轉(zhuǎn)染液；將轉(zhuǎn)染液直接加入細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集上清液，將上清液3 000 r/min(4℃)離心15 min，去除顆粒碎片[9]，-80℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融導(dǎo)致病毒滴度降低，使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況。

1.2.3HIV-1假病毒的RT-PCR鑒定 取300 μl病毒上清液，采用TRIzol一步法提取上清液中HIV-1假病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進(jìn)行 RT-PCR，對(duì)骨架質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP中的EGFP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物：上游EP1：ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG；下游EP2：CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃熱變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10 min，4℃保存，反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.4HIV-1假病毒感染iDC iDC作為感染靶細(xì)胞，用添加10%Gibco胎牛血清和1%青鏈霉素的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每1×106cells接種病毒液1 ml[10]，吸附1 h后棄去接種液補(bǔ)加10% 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞[11]，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)1個(gè)空白對(duì)照孔。

1.2.5HIV-1假病毒感染iDC后熒光蛋白表達(dá)觀察 HIV-1假病毒感染iDC后，將iDC繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用熒光顯微鏡觀察iDC中熒光蛋白表達(dá)情況，同時(shí)觀察正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的iDC。

1.2.6HIV-1假病毒感染iDC后電鏡觀察 用細(xì)胞刮將感染HIV-1假病毒3 h后的iDC刮下，得到細(xì)胞懸液，5 000 r/min離心20 min，吸棄上清，加500 μl 戊二醛固定，進(jìn)行透射電鏡觀察(透射電鏡：JEM-1200 EXⅡ，購(gòu)自日本電子公司)。

1.2.7HIV-1假病毒感染iDC后基因組整合檢測(cè) HIV-1假病毒感染iDC后，iDC繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用細(xì)胞刮刮取iDC，獲得細(xì)胞懸液，參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取iDC的基因組DNA，然后對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增EGFP基因，設(shè)未感染iDC為對(duì)照。

1.2.8HIV-1假病毒感染iDC后的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) HIV-1假病毒感染iDC后，iDC繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮刮取iDC，加約200 μl的PBS重懸，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增EGFP基因，設(shè)未感染iDC為對(duì)照，具體方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)酶切鑒定結(jié)果 質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP的全長(zhǎng)為14.7 kb，經(jīng)PstⅠ單酶切后得到4個(gè)條帶，片段大小約為8 000、3 000、2 000和 1 300 bp(圖1)；質(zhì)粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)全長(zhǎng)為8 440 bp，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到目的片段env/rev，大小約為3 000 bp，另一個(gè)條帶約為5 000 bp(圖2)，得到正確目的片段，證明pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)可以用于HIV-1假病毒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。

2.2pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)大量制備濃度及純度測(cè)定結(jié)果 用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒要求分光光度儀測(cè)定其OD260/OD280值在1.6到1.8之間，證明質(zhì)粒純度較好，無蛋白和RNA污染。質(zhì)粒pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)濃度及純度如表1所示，符合要求，可以用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.3HIV-1假病毒包裝實(shí)驗(yàn) 正常培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞如圖3A所示；pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15) 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后，觀察到293T細(xì)胞略微變圓、積聚、顏色稍有加深(圖3B)，并沒有其他病變特征；在熒光顯微鏡下觀察，可以看到細(xì)胞中有綠色熒光，證明經(jīng)轉(zhuǎn)染后pNL4-3-ΔE-EGFP中的EGFP基因在293T細(xì)胞中得到表達(dá)(圖3C、D)。轉(zhuǎn)染48 h后，理論上包裝出的HIV-1假病毒存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液于-80℃保存?zhèn)溆?，并離心處理細(xì)胞碎片，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增EGFP基因，結(jié)果得到約700 bp的目的片段，與pNL4-3-ΔE-EGFP中插入的外源基因EGFP片段大小相同(圖4A)，設(shè)β-actin為內(nèi)參對(duì)照(圖4B)。

圖1 pNL4-3-ΔE-EGFP的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Analysis of pNL4-3-ΔE-EGFP by enzyme digestionNote: M.DNA marker λEcoT14I;1.pNL4-3-ΔE-EGFP;2.pNL4-3-ΔE-EGFP digested by PastⅠ.

圖2 pTHRO4156 clone 18(SVPB15)的酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Analysis of pTHRO4156 clone 18(SVPB15)by enzyme digestionNote: M.DNA Marker λEcoT14I;1.pTHRO4156 clone 18(SVPB15);2.pTHRO4156 clone 18(SVPB15) digested by BamH Ⅰ/Hind Ⅲ.

2.4HIV-1假病毒感染iDC后iDC中EGFP表達(dá) HIV-1假病毒感染iDC 24 h后細(xì)胞未發(fā)生病變(圖5A)，與未感染的iDC形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)都沒有區(qū)別，但熒光顯微鏡觀察到被感染的iDC中存在綠色熒光(圖5B)，證明EGFP在iDC中獲得表達(dá)，初步提示HIV-1假病毒可以感染iDC。

表1 pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB-15)濃度及純度

圖3 293T細(xì)胞觀察Fig.3 Observation of 293T cellsNote: A.Normal 293T cell(×200);B.293T cells transfected by plasmid(×200);C/D.EGFP observation of the 293T cells transfected by plasmid(×200).

2.5HIV-1假病毒感染iDC后透射電鏡觀察 對(duì)感染HIV-1假病毒3 h后的iDC進(jìn)行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)存在疑似病毒粒子，通過電鏡拍攝下的病毒形態(tài)、病毒粒子大小及存在于兩細(xì)胞間的位置，表明該病毒粒子可能為結(jié)合在iDC表面的病毒粒子(圖6)。

圖4 β-actin檢測(cè)Fig.4 β-actin identificationNote: β-actin PCR amplification:M.DL2000 DNA marker;1.H2O control;2.Positive control;3.RT-PCR product of HIV-1 pseudovirus;4.RT-PCR product in control of normal 293T cells supernatant.

圖5 iDC觀察Fig.5 Observation of iDCNote: A.iDC infected by HIV-1 pseudovirus(×200);B.EGFP observation of the iDC infected by HIV-1 pseudovirus(×200).

圖6 病毒結(jié)合與捕獲試驗(yàn)(透射電鏡，×6 000)Fig.6 Virus binding and capture assay(Observation of transmission electron microscopy，×6 000)

圖7 HIV-1假病毒感染iDC基因組整合檢測(cè)Fig.7 Genome integration level detection of HIV-1 pseudovirusNote: EGFP of genome of iDC PCR amplification:M.DL2000 DNA marker;1.Genome of iDC infected by HIV-1 pseudovirus;2.Genome of normal iDC.

圖8 RT-PCR檢測(cè)HIV-1假病毒感染iDC的mRNAFig.8 RT-PCR identification of mRNA of iDC infected by HIV-1 pseudovirusNote: EGFP of mRNA of iDC PCR amplification:M.DL2000 DNA Marker;1.RT-PCR product in control of mRNA of normal iDC;2.RT-PCR product of mRNA of iDC infected by HIV-1 pseudovirus.

2.6HIV假病毒感染iDC后基因組整合檢測(cè)結(jié)果 HIV-1假病毒感染iDC 24 h后提取iDC的基因組，得到cDNA，利用EGFP特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到700 bp條帶(圖7)，與EGFP條帶的大小一致，證明HIV-1假病毒感染iDC后其RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄整合到iDC基因組中。

2.7HIV-1假病毒感染iDC后的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)結(jié)果 HIV-1假病毒感染iDC 24 h后提取iDC的RNA，進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用EGFP特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到了700 bp條帶，與EGFP條帶的大小一致(圖8)，證明HIV-1假病毒感染iDC后在iDC中正常轉(zhuǎn)錄，mRNA得到表達(dá)。

3 討論

我們構(gòu)建HIV-1假病毒，其基因組中的表達(dá)膜蛋白的基因失活，需要外源膜蛋白基因共轉(zhuǎn)染才能包裝出HIV-1假病毒顆粒，因此，HIV-1感染細(xì)胞iDC后，iDC中沒有外膜蛋白包裝基因，HIV-1不能進(jìn)一步復(fù)制產(chǎn)生新一輪的病毒，降低了生物危險(xiǎn)性，同時(shí)增加了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。HIV-1假病毒的細(xì)胞嗜性和感染過程與真病毒相似，在研究病毒與細(xì)胞間相互作用時(shí)，直接感染靜止培養(yǎng)的iDC，可以模擬病毒感染的早期過程，這樣可以更好地理解與闡釋病毒與細(xì)胞的相互作用，為病毒感染與致病機(jī)制提供重要線索，對(duì)抗艾滋病DC疫苗與藥物的研制奠定理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)中HIV-1假病毒骨架質(zhì)粒為pNL4-3-ΔE-EGFP，它源于HIV-1原病毒克隆的pNL4-3，在env開放閱讀框中攜帶EGFP基因，EGFP是從pEGFP-N1質(zhì)粒上擴(kuò)增得到的，通過KpnⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)插入pNL4-3主鏈。pNL4-3-ΔE-EGFP表達(dá)一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固定的去除頂端的Env-EGFP融合蛋白[12]。外膜蛋白包轉(zhuǎn)質(zhì)粒pTHRO4156 clone 18(SVPB15)包含全長(zhǎng)env和rev基因，源于一個(gè)進(jìn)化枝B型病毒感染的實(shí)驗(yàn)者，通過RT-PCR擴(kuò)增得到。env/rev片段通過HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)連接到pcDNA3.1(+)表達(dá)載體上，克隆表達(dá)一個(gè)有用的env/rev，可以構(gòu)建假性感染性病毒[13]。對(duì)于B型病毒(SVPB15)來說，pTHRO4156.18 env包含假病毒粒子后屬于標(biāo)準(zhǔn)病毒中和模型。pNL4-3-ΔE-EGFP和pTHRO4156 clone 18(SVPB15)構(gòu)建的HIV-1假病毒是HIV-1報(bào)告病毒，可以被用于HIV-1抗藥性的表型分析，用于測(cè)定針對(duì)HIV-1 gag-pol結(jié)構(gòu)域決定的病毒復(fù)制能力。

實(shí)驗(yàn)中293T細(xì)胞系在骨架質(zhì)粒和外膜蛋白包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后包裝HIV-1假病毒。最佳化的293T生產(chǎn)細(xì)胞系在人類CMV啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定表達(dá)SV40 大T抗原，是病毒產(chǎn)量處于最佳化，同時(shí)維持HIV-1假病毒的生存環(huán)境[14]。HIV-1假病毒易于濃縮，具有良好的安全性、廣泛的宿主范圍和更高的轉(zhuǎn)染效率，可以應(yīng)用于研究病毒與宿主細(xì)胞之間相互關(guān)系、評(píng)價(jià)中和抗體效價(jià)以及基因治療方面，是一種新型、安全的實(shí)驗(yàn)工具。

體外分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng)CD14+單核細(xì)胞被認(rèn)為是獲得具有良好細(xì)胞活力iDC最普遍的途徑[15]，我們構(gòu)建的HIV-1假病毒每一次凍融病毒滴度會(huì)降低10%，因此，病毒液儲(chǔ)于-80℃保存，感染實(shí)驗(yàn)中是將病毒液融化后感染iDC。HIV-1感染iDC實(shí)驗(yàn)一方面是對(duì)HIV-1假病毒的感染活性作以鑒定，另一面是模擬HIV-1的感染過程，尋找病毒的作用靶標(biāo)，探索病毒與靶細(xì)胞的相互作用。HIV-1假病毒感染進(jìn)入iDC，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)入細(xì)胞核[16]，穩(wěn)定地整合到宿主基因組中[17]，EGFP作為報(bào)告基因易于檢測(cè)，因此，通過觀察iDC中EGFP的表達(dá)、測(cè)定iDC的mRNA和基因組cDNA，可以判斷HIV假病毒是否感染細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIV-1能夠成功感染iDC，其RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄可以整合到iDC基因組中，并得到表達(dá)，從而為開展HIV-1與宿主細(xì)胞相互作用研究奠定了基礎(chǔ)。

HIV感染DC的研究尚處于起步階段，還有許多問題有待于進(jìn)一步闡明和證實(shí)，比如HIV-1假病毒的功能和單輪感染活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；iDC攝取HIV-1假病毒后，iDC內(nèi)部發(fā)生了哪些改變，激活了哪些信號(hào)通路，從而導(dǎo)致iDC分化為mDC等等。本課題組將開展HIV-1感染DC的差異蛋白組學(xué)研究，通過生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步了解HIV-1感染過程對(duì)iDC造成的影響，相信實(shí)驗(yàn)研究的深入和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展會(huì)為HIV的靶向性抗病毒研發(fā)提供新的思路。

[1] 李莉平,康佳麗,夏 薇.HIV致病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2007,23(9):886-889.

[2] Kawamura T,Cohen SS,Borris DL,etal.Candidate microbicides block HIV-1 infection of human immature langerhans cells within epithelial tissue explant[J].J Exp Med,2000,192(10):1491-1500.

[3] 閏素仙,于 輝,謝影哲,等.樹突狀細(xì)胞交叉遞呈外源抗原的機(jī)制研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016,32(9):1272-1275.

[4] Mintern JD,Macri C,Wei JC,etal.Differential use of autophagy by primary dendritic cells specialized in cross-presentation[J].Autophagy,2015,11(6):906-917.

[5] Segura E,Amigorena S.Cross-presentation by human dendritic cell subsets[J].Iramunol Lett,2014,158(1-2):73-78.

[6] 王艷海,韓曉旭.HIV-1假病毒的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2012,44(7):817-821.

[7] 朱 娜,王海桃,李 昌,等.未成熟樹突狀細(xì)胞快速分離與體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及其鑒定研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2017,33(7):1043-1047.

[8] 薩姆布魯克 J,拉塞爾 DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2002：93-99.

[9] 仇 超,彭 虹,黃相剛,等.攜帶綠色熒光蛋白基因的單輪感染活性HIV假病毒的建立及其活性檢測(cè)[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(5):394-398.

[10] 朱曉蕾,盧 春,呂志剛,等.HIV-1假病毒的構(gòu)建及對(duì)人原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞系的感染研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,28(5):565-569.

[11] Zandi F,Eslami N,Soheili M,etal.Proteomics analysis of BHK-21 cells infected with a fixed strain of rabies virus[J].Proteomics,2009,9(9):2399-2407.

[12] Zhang H,Zhou Y，Alock C,etal.Novel single-cell-level phenotypic assay for residual drug susceptibility and reduced replication capacity of drug-resistant human immunodeficiency virus type 1[J].J Virol,2004,78(4):1718-1729.

[13] Li M,Gao F,Mascola JR,etal.Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies[J].J Virol,2005,79(16):10108-10125.

[14] 孫丹丹,李 昌,李太元,等.HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2012,28(5):440-443.

[15] 王茂鵬,杜壽文,李 昌,等.人樹突狀細(xì)胞分離與鑒定最新研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2013,29(10):1093-1097.

[16] Lewis PF,Emerman M.Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for the human immunodeficiency virus[J].J Virol,1994,68(1):510-516.

[17] Buchschacher GL Jr,Wong-Staal F.Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases[J].Blood,2000,95(8):2499-2504.

[收稿2017-06-03 修回2017-07-25]

(編輯 張曉舟)

ExperimentalstudyonimmaturaldendriticcellsinfectedbyHIV-1pseudovirus

ZHUNa,LIUXue-Li,QIUNi,ZHANGJie-Ting，WUShi-Pin,LITi-Yuan,GUOYan,LIChang,JINNing-Yi.
PharmacyDepartmentoftheQingdaoCenterHospital,Qingdao266042，China

Objective:To construct HIV-1 pseudovirus containing enhanced green fluorescent protein(EGFP)gene.To understand the interaction between the virus and the cells.MethodsHIV-1 pseudovirus containing EGFP gene was constructed by lentiviral packaging systems,and its EGFP gene was amplified using RT-PCR.The level of genomic integration and transcription of HIV-1 pseudovirus containing EGFP gene were detected on iDCs infected with HIV-1 pseudovirus.At the same time,research on expression of the EGFP gene in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus was performed.ResultsThe EGFP gene of HIV-1 pseudovirus was detected through RT-PCR.The EGFP gene was identified in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus through PCR and RT-PCR.The EGFP was observed in iDCs infected with HIV-1 pseudovirus under fluorescence microscopy.ConclusionHIV-1 pseudovirus containing EGFP gene has been successfully produced.The HIV-1 pseudovirus that we constructed can infect iDCs,then its RNA can integrate into the genome of iDCs in the way of reverse transcription,and the EGFP gene could express in the iDCs after infected with HIV-1 pseudovirus.

HIV-1 pseudovirus;Immatural dendritic cell;Infection experiment

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(31472197)、病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLPBS1435)、北京市自然科學(xué)基金(5152023)和吉林省青年科研基金項(xiàng)目(20140520173JH)資助。

②暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)院，深圳市人民醫(yī)院，深圳 518000。

③長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117。

④軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，省部共建吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062。

R392

A

1000-484X(2017)10-1441-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.001

朱 娜( 1986年-)，女，碩士，主要從事臨床藥學(xué)研究,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: merryzhuna@163.com。

及指導(dǎo)教師：郭 焱(1963年-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: ccguoyan@163.com。李 昌(1978年-)，男，博士，教授，副研究員，主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: lichang78@163.com。金寧一(1956年-)，男，博士，中國(guó)工程院院士，博士生導(dǎo)師,主要從事微生物與免疫方面的研究，E-mail: ningyij@hotmail.com。