項海東 李浩渤 陳惠珍

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，石家莊 050000)

脂多糖調(diào)控Notch信號通路作用于人牙髓干細(xì)胞增殖、分化、凋亡的實驗研究

項海東 李浩渤 陳惠珍

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，石家莊 050000)

目的探討脂多糖調(diào)控Notch信號通路對人牙髓干細(xì)胞增殖、分化、凋亡的影響及機(jī)制。方法從牙髓組織中分離出人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)，CCK8實驗檢測0、0.1、1、10 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 1、3、5、7 d后細(xì)胞的增殖情況；RT-PCR檢測1 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 0、3、7、14、21 d后礦化相關(guān)基因ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測1 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 0、7、14、21 d后的細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)。結(jié)果不同濃度的脂多糖刺激hDPSCs 1、3、5 d后細(xì)胞的增殖均無顯著差異，培養(yǎng)至第7天時，0.1、1、10 μg/ml的脂多糖組細(xì)胞的增殖均顯著低于0 μg/ml的脂多糖組(P<0.01)；脂多糖處理hDPSCs 3 d時ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，7、14、21 d時ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01)；脂多糖處理hDPSCs 7、14、21 d時細(xì)胞的凋亡率及Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01)，21 d時ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)及細(xì)胞凋亡率和Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均有下降趨勢。結(jié)論脂多糖可降低hDPSCs的增殖，促進(jìn)其礦化和凋亡，其機(jī)制與激活Notch信號通路有關(guān)。

脂多糖；Notch信號通路；人牙髓干細(xì)胞；增殖；分化；凋亡

干細(xì)胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，可分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)是成體干細(xì)胞的一員，是口腔醫(yī)學(xué)研究的熱點，具有很強(qiáng)的增殖潛能，在體外適當(dāng)誘導(dǎo)下能向成脂、成骨/成牙、成神經(jīng)等方向分化，對于牙髓組織的重建及修復(fù)損傷等有重要影響[1,2]。細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysacchar-ide，LPS)是革蘭氏陰性菌主要的致病因子，在間充質(zhì)干細(xì)胞的分化及增殖中有重要作用[3]。有研究顯示，高劑量的脂多糖能抑制牙髓細(xì)胞分化為牙本質(zhì)細(xì)胞，并誘導(dǎo)牙周細(xì)胞及牙髓細(xì)胞的凋亡，在牙髓損傷時脂多糖也會刺激牙髓組織中的牙髓干細(xì)胞，而目前脂多糖對牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性及機(jī)制的研究尚不清楚[4,5]。因此，本研究從牙髓組織中分離出牙髓干細(xì)胞，研究脂多糖對其增殖、凋亡、分化的影響及機(jī)制，以期為牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；脂多糖購自美國Invivogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa；RNA提取試劑盒購自美國Omega；BCA試劑盒、CCK8試劑盒；Annexin V-FITC凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；Cleaved caspase3、Notch1、Hes1單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國Abcam公司；實時定量PCR儀購自美國Applied Biosystems；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國SIM公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS；酶標(biāo)儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1hDPSCs的分離培養(yǎng) 經(jīng)患者知情同意后，從河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔頜面外科門診收集18～24歲患者因阻生新鮮拔除或正畸減數(shù)的新鮮健康恒牙，用含有青鏈霉素雙抗的PBS洗滌離體牙2次后，牙齒表面滅菌后取出牙冠，分離牙髓，用小剪刀將牙髓組織剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的小塊，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清，按照1∶1比例加入0.4%的dispase酶和0.3%的Ⅰ型膠原酶，37℃消化1 h，1 000 r/min離心5 min，吹打單細(xì)胞團(tuán)塊形成單細(xì)胞懸液，過70 μm濾篩，1 000 r/min離心 5 min，20%的PBS洗滌細(xì)胞1次，細(xì)胞沉淀用高糖DMEM培養(yǎng)基(含20%的胎牛血清)重懸，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每3 d換液1次，顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，收集對數(shù)生長期的培養(yǎng)上清備用，細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后傳代。

1.2.2脂多糖對hDPSCs增殖的影響 取生長至對數(shù)期的hDPSCs，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×103個/孔，以每孔200 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1、3、5、7 d，每個時間點又分為0、0.1、1、10 μg/ml的脂多糖處理，用含有10%的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基刺激hDPSCs，每3 d換液1次，各組細(xì)胞培養(yǎng)到指定時間后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定并記錄各組的吸光度(A)。

1.2.3脂多糖對hDPSCs礦化相關(guān)基因ALP、DSPP、DMP1表達(dá)的影響 實驗分為兩組，即對照組和1 μg/ml的脂多糖處理組，每組設(shè)置0、3、7、14、21 d五個時間點。將生長至對數(shù)期的第四代hDPSCs制成單細(xì)胞懸液，以2×105的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照實驗分組進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，礦化誘導(dǎo)至相應(yīng)時間后，根據(jù)細(xì)胞蛋白試劑盒說明提取細(xì)胞中的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的人mRNA序列設(shè)計目的基因 ALP、DSPP、DMP1及內(nèi)參基因GAPDH的RT-PCR定量引物。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：ALP上游引物：5′-CCACGTCTTCACATTTGGTG-3′，下游引物：5′-AGACTGCGCCTGGTAGTTGT-3′；DSPP上游引物：5′-TGGAGACAAGACCTCCAAGAGTGA-3′，下游引物：5′-TGCTGGGACCCTTGAATTTCTATTC-3′；5′-AGA-CTGCGCCTGGTAGTTGT-3′；DMP1上游引物：5′-TGG-GGATTATCCTGTGCTCT-3′，下游引物：5′-GCTGTCACTGGGGTCTTCAT-3′。GAPDH引物序列：上游引物：5′-AAGAGTGGGTTTAAGTGGAAGGCT-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：A：預(yù)變性95℃ 10 min；B：變性95℃ 10 s；退火60℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，共40個循環(huán)溫度：72℃ 15 min。4℃終止反應(yīng)。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，取均值采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

1.2.4脂多糖對hDPSCs凋亡的影響 實驗分為兩組，即對照組和1 μg/ml的脂多糖處理組，每組設(shè)置7、14、21 d三個時間點。收集按照分組培養(yǎng)至對數(shù)期的hDPSCs，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后，再用結(jié)合緩沖液各洗滌細(xì)胞1次，離心，棄上清，加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液加入5 μl的PI和 Annexin-V-FITC，充分混勻后置于37℃條件下避光靜置20 min，再加400 μl結(jié)合緩沖液，上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5脂多糖對Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)的影響 實驗分為兩組，即對照組和1 μg/ml的脂多糖處理組，每組設(shè)置7、14、21 d三個時間點。取按照分組培養(yǎng)至對數(shù)期的hDPSCs，提取細(xì)胞中的蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒檢測提取的蛋白質(zhì)量。配置12%分離膠及5%的濃縮膠，按照1∶1比例將蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，置于100℃煮沸變性10 min，緩慢冷卻后進(jìn)行分裝，置于-80℃冰箱中保存。取變性蛋白進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電泳結(jié)束后依次PVDF轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂奶粉封閉、一抗孵育( Notch1、Hes1按1∶500稀釋，GAPDH按1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜、二抗孵育(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋)，37℃ 孵育1 h，洗膜3次，ECL發(fā)光劑顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1脂多糖降低hDPSCs增殖 CCK8實驗檢測0、0.1、1、10 μg/ml的脂多糖處理1、3、5、7 d后的細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，不同濃度的脂多糖刺激hDPSCs 1、 3、5 d后細(xì)胞的增殖均無顯著差異，培養(yǎng)至第7天時，0.1、1、10 μg/ml的脂多糖組細(xì)胞的增殖均顯著低于0 μg/ml的脂多糖處理組(P<0.01)。這說明脂多糖對hDPSCs 的刺激在較短時間內(nèi)對細(xì)胞增殖無明顯影響，長時間脂多糖刺激可能引起細(xì)胞增殖下降。見圖1。

2.2脂多糖促進(jìn)hDPSCs的礦化相關(guān)基因表達(dá) RT-PCR檢測1 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 0、3、7、14、21 d后礦化相關(guān)基因 ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示，脂多糖處理hDPSCs 3 d時ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)與對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，脂多糖處理hDPSCs 7、14、21 d后ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01)，21 d時ALP、DSPP、DMP1的mRNA表達(dá)有下降的趨勢。見圖2。

圖1 脂多糖對hDPSCs增殖的影響Fig.1 Effect of lipopolysaccharide on proliferation of hDPSCsNote:Compared with the control group 0 g/ml,**.P<0.01.

2.3脂多糖促進(jìn)hDPSCs的凋亡 流式細(xì)胞儀檢測1 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 0、7、14、21 d后細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，7、14、21 d時細(xì)胞的凋亡率均顯著高于對照組(P<0.01)，21 d時細(xì)胞凋亡率有下降趨勢。見圖3。

2.4脂多糖對Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測1 μg/ml的脂多糖處理hDPSCs 0、7、14、21 d后Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，脂多糖處理hDPSCs 7、14、21 d時Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01)，21 d時Cleaved caspase3、Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)有下降趨勢。見圖4。

圖2 脂多糖對hDPSCs的ALP、DSPP、DMP1表達(dá)的影響Fig.2 Effect of lipopolysaccharide on expression of ALP,DSPP and DMP1 in hDPSCsNote:Compared with the control group 0 d,**.P<0.01.

圖3 脂多糖對hDPSCs凋亡的影響Fig.3 Effect of lipopolysaccharide on apoptosis of hDPSCsNote:A.Flow cytometry results;B.The apoptosis rate of cell.Compared with the control group 0 d,**.P<0.01.

圖4 脂多糖對Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of lipopolysaccharide on expression of Cleaved caspase3,Notch1 and Hes1 proteins

3 討論

近些年來，成體干細(xì)胞由于對組織修復(fù)和再生的影響受到大量研究者的關(guān)注。牙髓干細(xì)胞是牙髓組織中存在的一種成體干細(xì)胞，同樣具有增殖、多向分化及自我更新能力。牙髓干細(xì)胞除了能分化為脂肪干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞外，還能形成牙本質(zhì)牙髓樣復(fù)合體，牙髓樣復(fù)合體是未來牙再生的第一步，這也說明牙髓干細(xì)胞在活髓保存治療中的重要作用[6]。脂多糖是內(nèi)毒素主要的致病因素，可直接影響牙髓細(xì)胞[7]。研究顯示，低濃度的脂多糖能夠使牙髓成纖維細(xì)胞與基質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而高濃度的脂多糖可抑制牙髓細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶活性[8]。堿性磷酸酶(ALP)是一種磷酸單酯水解酶，參與骨、牙齒等的再生、代謝、形成等過程[9]。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)是一種活性蛋白，參與細(xì)胞的成牙及成骨等的分化[10]。牙本質(zhì)涎蛋白(DSPP)是由成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌，在牙本質(zhì)形成、牙本質(zhì)分化及礦化過程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究檢測脂多糖對牙髓干細(xì)胞增殖及ALP、DMP1、DSPP的mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，脂多糖能降低牙髓干細(xì)胞的增殖及上調(diào)ALP、DMP1、DSPP的mRNA表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞功能的一個重要部分，可清除一些特定的細(xì)胞，對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、生物體的進(jìn)化及個體的生長發(fā)育有重要影響。在牙胚組織、牙源性細(xì)胞的發(fā)育過程中凋亡也起到了重要作用[12]。研究顯示，細(xì)胞凋亡可影響牙胚發(fā)育過程中的形態(tài)及結(jié)構(gòu)[13]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白，屬于Caspase家族成員，在正常組織中主要以無活性的形式存在，多種凋亡途徑最終都會引起Caspase-3的活化，活化的Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞以凋亡的形式解體[14,15]。本研究檢測脂多糖對牙髓干細(xì)胞及Cleaved caspase3蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，脂多糖可誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞凋亡及上調(diào)Cleaved caspase3蛋白表達(dá)。

Notch信號通路是在進(jìn)化過程中高度保守的一條信號通路，在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛存在，在細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮重要作用[16]。隨著牙髓干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及鑒定，Notch信號通路在牙髓干細(xì)胞中的調(diào)控作用也得到研究[17]。研究顯示，Notch信號通路的激活可降低牙髓干細(xì)胞的增殖及分化，在牙齒損傷中也可檢測到Notch信號通路的激活[18]。本研究檢測Notch信號通路相關(guān)蛋白Notch1、Hes1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，脂多糖可顯著上調(diào)Notch1、Hes1蛋白表達(dá)。 綜上所述，脂多糖可通過激活Notch信號通路降低hDPSCs的增殖，促進(jìn)其礦化和凋亡。該研究為牙髓損傷修復(fù)的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2017-03-27 修回2017-06-03]

(編輯 許四平 劉格格)

Effectsoflipopolysaccharideonproliferation,differentiationandapoptosisofhumandentalpulpstemcellsbyNotchsignalingpathway

XIANGHai-Dong,LIHao-Bo,CHENHui-Zhen.
DepartmentofOralMedicine，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective:To investigate the effects and its mechanism of lipopolysaccharide on the proliferation,differentiation and apoptosis of human dental pulp stem cells by Notch signaling pathway.MethodsHuman dental pulp stem cells(hDPSCs)was isolated from dental pulp tissue;cell proliferation was detected after 0,0.1,1,10 μg/ml treated cells for 1,3,5,7 days by CCK8 test;related mRNA expression ALP,DSPP,DMP1 gene was detected after 1 μg/ml lipopolysaccharide treated hDPSCs for 0,3,7,14,21 day by RT-PCR;cell apoptosis was detected after 1 μg/ml lipopolysaccharide treated hDPSCs for 0,7,14,21 day by flow cytometry.Cleaved caspase3,Notch1,Hes1 protein expression was detected by Western blot.ResultsCell proliferation after different concentrations lipopolysaccharide stimulated hDPSCs for 1,3,5 days had no significant difference,significantly lower at 7 day than 0 μg/ml lipopolysaccharide group(P<0.01).ALP,DSPP,DMP1 mRNA expression lipopolysaccharide treated hDPSCs at 3 day compared with the control group had no statistical significance(P>0.05),significantly higher at 7,14,21 day than control group(P<0.01);cells apoptosis rate and Cleaved caspase3,Notch1,Hes1 protein expression lipopolysaccharide treatment hDPSCs at 7,14 and 21day was significantly higher than the control group(P<0.01);ALP,DSPP,DMP1 mRNA expression and apoptosis rate and Cleaved caspase3,Notch1,Hes1 protein expression at 21 day was a downward trend.ConclusionLipopolysaccharide can decrease the proliferation of hDPSCs and promote its mineralization and apoptosis,which may be related to the activation of Notch signaling pathway.

Lipopolysaccharide;Notch signaling pathway;Human dental pulp stem cells;Proliferation;Differentiation;Apoptosis

R781

A

1000-484X(2017)10-1483-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.009

項海東 (1982年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事牙體牙髓及牙周病研究，E-mail:67556483@qq.com。

及指導(dǎo)教師：陳惠珍(1957年-)，女，主任醫(yī)師，主要從事牙體牙髓、牙周病及口腔黏膜病研究，E-mail：kqchenhuizhen@163.com。