戰(zhàn) 鵬 范海濤 張 明 馮樹強(qiáng) 鄭紅淑

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，長春 130041)

反義缺氧誘導(dǎo)因子-1α對人膀胱癌細(xì)胞生長的影響①

戰(zhàn) 鵬 范海濤 張 明 馮樹強(qiáng) 鄭紅淑

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，長春 130041)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率和病死率均居首位的惡性實(shí)體腫瘤。近年研究發(fā)現(xiàn)人類絕大多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤，其內(nèi)存在低氧微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞會(huì)激活一系列相關(guān)分子信號(hào)傳導(dǎo)途徑以適應(yīng)缺氧微環(huán)境，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞自身的侵襲性和對放化療的抗拒性，致使療效降低，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)起到了更為關(guān)鍵的樞紐作用。近期有關(guān)HIF-1α作為癌基因在人體多種惡性實(shí)體腫瘤中過表達(dá)和針對其用藥治療的有效性報(bào)道較多[1,2]。但在以HIF-1α為靶點(diǎn)的膀胱癌研究治療卻鮮見報(bào)道。為此我們通過反義寡核苷酸技術(shù)，抑制膀胱癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)，觀察反義HIF-1α(AS-HIF-1α)對癌細(xì)胞生長的影響，探討其作為癌基因用于人膀胱癌靶向分子治療的可能性和有效性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 反義和隨機(jī)對照寡核苷酸購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，反義HIF-1α(AS-HIF-1α)為5′-GCCTCTGTGGGTTTGCCTAGTGTTTC，隨機(jī)對照序列為5′-ATTGGTAAGGATGACAGTGTA-ATTTC。在Genbank中行Blastn檢測，證實(shí)ASODN與任何其他已知哺乳動(dòng)物基因無匹配。DMEM和脂質(zhì)體Lipofecta minc2000購自Gibco公司，Trizol試劑盒購自Invitrogen公司。人膀胱癌細(xì)胞株T24購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 ①T24細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：用含10%的滅活胎標(biāo)準(zhǔn)小牛血清RDMI1640培養(yǎng)液，在37℃，2%CO2卵育箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)，直到T24細(xì)胞成對數(shù)生長，細(xì)胞克隆并篩選。用Lipofectaminc2000，按照說明書所述方法分3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞。即AS-HIF-1α轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染無義序列組和空白對照組。②RNA提取及Western blot檢測:按照Trizol試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，采用Western blot檢測HIF-1α表達(dá)量。③檢測T24細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞周期和凋亡變化 在細(xì)胞被轉(zhuǎn)染72 h后，用MTT比色法測定細(xì)胞增殖率，F(xiàn)CM鑒定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1HIF-1α在3組細(xì)胞中的表達(dá) Western blot法檢測結(jié)果(見圖1)顯示，AS-HIF-1α轉(zhuǎn)染組的HIF-1α表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)染無義序列組和對照組的HIF-1α表達(dá)明顯上調(diào)。膀胱癌細(xì)胞中的HIF-1α表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，提示HIF-1α可能作為一種致癌基因參與了膀胱癌發(fā)生發(fā)展的過程。

2.2HIF-1α對T24細(xì)胞增殖的作用MTT比色法 分別檢測了3組細(xì)胞的增殖率，結(jié)果(見圖2)依次為，AS-HIF-1α組57.4%，轉(zhuǎn)染無義序列組94.8%，對照組100%。上述3組間分別比較，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染無義序列組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AS-HIF-1α通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞HIF-1α表達(dá)抑制體外T24細(xì)胞增殖的作用，為今后臨床膀胱癌的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.3HIF-1α對T24細(xì)胞周期變化和凋亡的影響 FCM分析結(jié)果(見圖3)顯示，AS-HIF-1α組，轉(zhuǎn)染無義序列組和對照組的G0/G1期細(xì)胞分別是59.2%，48.7% 和45.9%；S期分別是21.5%，32.6%和35.8%。AS-HIF-1α組S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞大多阻滯在G0/G1期，對照組和無義序列組幾乎無變化(P>0.05)。AS-HIF-1α組與對照組和無義序列組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AS-HIF-1α組，對照組和無義序列組的細(xì)胞凋亡率依次是15.9%，2.4 %和3.1%。AS-HIF-1α組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他兩組，差異比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而對照組和無義序列組比較，差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 HIF-1α在不同3組中的表達(dá)(SP×400)Fig.1 Expression of HIF-1α in different three groups(SP×400)

圖2 MTT法檢測T24細(xì)胞的增殖率Fig.2 Detect proliferation rate of T24 cells by MTT

3 討論

據(jù)流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)，膀胱癌雖可發(fā)生在任何年齡，但其發(fā)病年齡高峰是在中年以后，發(fā)病率隨年齡增加而上升，并且男性多于女性。膀胱癌的特點(diǎn)是發(fā)病率高，治療后易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后惡性程度增高[3,4]。因此早期診斷，提高療效，預(yù)防復(fù)發(fā)對膀胱癌來說既是難點(diǎn)也是熱點(diǎn)。隨著對腫瘤分子生物學(xué)研究的深入和癌基因?qū)W說的確立，癌基因檢測和針對癌基因的分子靶向治療成為目前腫瘤研究與治療的熱點(diǎn)之一。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在人體多種惡性實(shí)體腫瘤中過表達(dá)，并被證實(shí)既能促進(jìn)腫瘤本身發(fā)生發(fā)展也與化療耐藥密切相關(guān)[3，5]。提示HIF-1α在腫瘤中的致癌作用與生物學(xué)行為具有普遍性。Nurwidya等[6]報(bào)道在人體幾乎所有惡性實(shí)體腫瘤中檢測到了一種類似的致癌因子——缺氧誘導(dǎo)因子-1α，該因子的表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果使我們有理由推測，應(yīng)用HIF-1α的干擾物或阻礙物，通過轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可能有助于抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，這一作用可能是通過降解癌基因蛋白，阻斷腫瘤分子信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的[7]。

反義寡核苷酸技術(shù)是一門業(yè)已發(fā)展成熟的腫瘤生物治療方法，已被推薦用于癌癥、病毒感染和遺傳性疾病的治療[8-10]。本研究用反義技術(shù)，針對HIF-1α設(shè)計(jì)其反義寡核苷酸，觀察AS-HIF-1α對人膀胱癌T24細(xì)胞株的作用。結(jié)果提示，抑制T24細(xì)胞中過表達(dá)的HIF-1α后，該細(xì)胞增殖能力明顯下降，凋亡指數(shù)顯著上升，以及S期細(xì)胞比例減少。提示HIF-1α極有可能作為一種癌基因參與了臨床膀胱癌發(fā)生發(fā)展的過程。這使我們有理由推測對HIF-1α高表達(dá)的膀胱癌T24細(xì)胞，能夠通過反義技術(shù)有效抑制HIF-1α的表達(dá)，這為拓展臨床膀胱癌更加有效的靶向分子治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。

圖3 FCM檢測T24細(xì)胞周期和凋亡率Fig.3 Detect cell cycle and apoptosis rate of T24 by FCM

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[收稿2017-06-13 修回2017-09-05]

(編輯 許四平 劉格格)

①本文為吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101195JC)。

R737.14

A

1000-484X(2017)10-1557-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.10.024

戰(zhàn) 鵬(1985年-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤疾病方面研究。

及指導(dǎo)教師：張 明(1963年-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤疾病方面的研究,E-mail：zhang ming196312@163.com。