李 雪，曹 君，白新鵬，姜澤放，劉少杰，李 寧(海南大學(xué) 食品學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品開發(fā)重點實驗室,?？?70228)

水合法提取羅非魚魚油及其脂肪酸組成分析

李 雪，曹 君，白新鵬，姜澤放，劉少杰，李 寧
(海南大學(xué) 食品學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品開發(fā)重點實驗室,?？?70228)

以凍干的羅非魚粉為原料，采用酶解法和稀堿水解法分別提取羅非魚魚油，通過單因素試驗和正交試驗，確定兩種水合法的最佳工藝條件，并采用氣相色譜法分析羅非魚魚油脂肪酸組成。結(jié)果表明：稀堿水解法提取羅非魚魚油最佳工藝條件為料液比1∶3、pH 7.5、水解時間30 min、鹽析量2.5%、鹽析時間25 min、水解溫度65℃；酶解法提取羅非魚魚油最佳工藝條件為料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解溫度55℃、酶解時間2 h；在最佳工藝條件下，稀堿水解法的提油率為(32.13±0.07)%，略高于酶解法的(28.91±0.18)%；稀堿水解法提取羅非魚魚油n-3不飽和脂肪酸含量為(5.192±0.280)%，高于酶解法的(4.991±0.099)%。

羅非魚；魚油；酶解法；稀堿水解法；脂肪酸

羅非魚，又名非洲鯽魚，適應(yīng)能力較強，可在淡水和海水中生存，為雜食性魚類。目前我國廣州和海南的羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模較大，約占全國的1/3[1]。羅非魚肉肥、刺少，是目前較為物美價廉的魚類，被世界營養(yǎng)協(xié)會譽為“未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一”。 隨著人們對營養(yǎng)和保健的日益重視，魚油作為功能性油脂日益受到廣泛關(guān)注。魚油富含多不飽和脂肪酸及脂溶性維生素等，可改善視力、健腦益智、降低血壓、降低膽固醇等[2-5]。目前魚油提取方法主要為機械法、水合法(蒸煮法、酶解法、稀堿水解法)和超臨界流體萃取法等[6]。機械法主要采用物理壓榨制取魚油，出油率較低，且壓榨過程中，蛋白質(zhì)變性，但由于操作方法簡單，設(shè)備要求較低，是目前應(yīng)用最為廣泛的魚油提取方法。蒸煮法相較其他水合法而言，提取率較低，產(chǎn)品質(zhì)量較差，原料浪費較嚴(yán)重。超臨界流體萃取法是近年新型的萃取分離技術(shù)，對設(shè)備要求較高，不易大規(guī)模生產(chǎn)。

在傳統(tǒng)研究中，通常是將鮮魚進行簡單的清洗晾干，然后提取魚油。然而，該方法難以保證原料含水量的均一性。因此，本試驗采用冷凍干燥法預(yù)先處理原料，然后分別用酶解法和稀堿水解法提取羅非魚粉中的魚油，采用單因素試驗和正交試驗以確定兩種方法的最佳提油工藝，并對羅非魚魚油脂肪酸組成進行對比分析，為進一步科學(xué)地綜合利用羅非魚提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮羅非魚：?？谑惺郏丶s1.5 kg，長約25 cm，寬約14 cm。

堿性蛋白酶：源葉生物；氫氧化鉀、石油醚(沸程60～90℃)、硝酸鉀：分析純。

FDU-2100冷凍干燥機，GL-20G-II型高速冷凍離心機，SHZ-B恒溫水浴振蕩器，EV321旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，JM-B20002電子天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

羅非魚洗凈，晾干，去掉苦膽，切塊，在-18℃冰箱中冷凍24 h，放入真空冷凍干燥機，-80℃下，凍干48 h，粉碎，放入樣品袋，密封，存放于-80℃冰箱中待用。

1.2.2 稀堿水解法提取羅非魚魚油

取羅非魚魚粉30 g，加入適量去離子水，調(diào)節(jié)料液比，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH，將樣品放入水浴搖床中，在一定水解溫度下水解一定時間，再加入適量硝酸鉀，恒溫水浴鹽析一定時間，然后趁熱離心(8 000 r/min，10 min)，取上層液虹吸，抽濾，濾紙用石油醚沖洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，旋蒸瓶內(nèi)油脂即為羅非魚粗魚油，稱重，計算羅非魚提油率。

羅非魚提油率=提取魚油質(zhì)量/羅非魚魚粉質(zhì)量×100%

1.2.3 酶解法提取羅非魚魚油

取羅非魚魚粉30 g，加入適量去離子水，調(diào)節(jié)料液比，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH，然后加入適量堿性蛋白酶，將樣品放入恒溫水浴搖床中，在一定酶解溫度下酶解一定時間，結(jié)束后95℃水浴10 min滅酶，然后離心(8 000 r/min，10 min)，取上層液虹吸，抽濾，濾紙用石油醚沖洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至恒重，旋蒸瓶內(nèi)油脂即為羅非魚粗魚油，稱重，計算羅非魚提油率。

1.2.4 氣相色譜分析羅非魚魚油脂肪酸組成

參照文獻[7]的方法測定羅非魚魚油脂肪酸組成。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗進行3次平行試驗，應(yīng)用Origin9.0軟件進行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀堿水解法提取羅非魚魚油

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 料液比對提油率的影響

在pH 8、水解溫度55℃、水解時間30 min、鹽析量3%、鹽析時間15 min條件下，研究料液比對提油率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對提油率的影響

從圖1可以看出，提油率隨著料液比的增加先增大后下降。在料液比為1∶2.5時，提油率達到最大值26.78%，之后提油率開始大幅下降。原因可能是隨著料液比的增加，去離子水含量增大，稀釋堿濃度，影響堿的作用[8]。

2.1.1.2 pH對提油率的影響

在料液比1∶3、水解溫度55℃、水解時間30 min、鹽析量3%、鹽析時間15 min條件下，研究pH對提油率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對提油率的影響

從圖2可以看出，隨著pH的增大，堿性環(huán)境對蛋白質(zhì)與魚油結(jié)合的破壞更加充分，使提油率逐漸增大。在pH 8時，提油率達到最大值26.94%。而當(dāng)pH大于8時，魚油皂化現(xiàn)象嚴(yán)重，提油率逐漸降低，也可能是因為pH過高，促使魚油水解成游離脂肪酸[9]。

2.1.1.3 水解時間對提油率的影響

在料液比1∶3、pH 8、水解溫度55℃、鹽析量3%、鹽析時間15 min條件下，研究水解時間對提油率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 水解時間對提油率的影響

從圖3可以看出，隨著水解時間的延長，提油率增大，在水解時間為30 min時達到最大值25.4%，之后隨著水解時間的延長，魚油的氧化分解等反應(yīng)加劇，提油率降低。

2.1.1.4 水解溫度對提油率的影響

在料液比1∶3、pH 8、水解時間30 min、鹽析量3%、鹽析時間15 min條件下，研究水解溫度對提油率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 水解溫度對提油率的影響

從圖4可以看出，提油率隨水解溫度的升高先升高后降低，在水解溫度為55℃時達到最大值28.6%。水解溫度升高，加快蛋白質(zhì)和脂肪的分離速度，但是過高的溫度會加快魚油的氧化。且水解溫度超過55℃后，蛋白質(zhì)凝固變性，將魚油包裹，魚油析出量減少，提油率降低[10]。

2.1.1.5 鹽析量對提油率的影響

在料液比1∶3、pH 8、水解溫度55℃、水解時間30 min、鹽析時間15 min條件下，研究鹽析量對提油率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 鹽析量對提油率的影響

粗魚油中含有較多雜質(zhì)，加鹽鹽析的作用是破壞魚油形成的乳膠體，使魚油澄清。從圖5可以看出，鹽析量加大，使得蛋白質(zhì)鹽析沉淀，包裹魚油[10]。當(dāng)鹽析量超過3%后，進一步提高鹽析量，皂化物之前形成的膠體會發(fā)生解析從而使乳化更加嚴(yán)重，提油率下降[11]。

2.1.1.6 鹽析時間對提油率的影響

在料液比1∶3、pH 8、水解溫度55℃、水解時間30 min、鹽析量3%條件下，研究鹽析時間對提油率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 鹽析時間對提油率的影響

從圖6可以看出，一定的鹽析時間有助于魚油從乳狀液中分離出來,鹽析時間為20 min時，提油率最高；當(dāng)鹽析時間過長時,魚油容易發(fā)生分解,使提油率下降[12]。

2.1.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以料液比(A)、pH(B)、水解時間(C)、鹽析量(D)、鹽析時間(E)、水解溫度(F)為因素，提油率為指標(biāo)設(shè)計正交試驗。稀堿水解法提取羅非魚魚油正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 稀堿水解法提取羅非魚魚油正交試驗因素水平

表2 稀堿水解法提取羅非魚魚油正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，影響提油率的主次因素為 Bgt;Egt;Fgt;Agt;Dgt;C。羅非魚魚油的最佳提取方案為A3B1C3D2E2F3，即料液比1∶3、pH 7.5、水解時間30 min、鹽析量2.5%、鹽析時間25 min、水解溫度65℃。各因素R值均大于空列的R值，故各因素水平效應(yīng)的差異是存在的。在最佳試驗條件下，進行2次平行驗證試驗，提油率為(32.13±0.07)%。

2.2 酶解法提取羅非魚魚油

2.2.1 單因素試驗

2.2.1.1 料液比對提油率的影響

在加酶量0.2%、pH 8、酶解溫度60℃、酶解時間3 h的條件下，研究料液比對提油率的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 料液比對提油率的影響

從圖7可以看出，隨著料液比增加，提油率先增大后降低，料液比為1∶3時，提油率最高。料液比較低時，酶與底物接觸機會相對較少，反應(yīng)不完全，提油率較低。當(dāng)料液比超過一定量時，底物濃度較高，酶與底物不能均勻接觸，酶解效果相對較差[13-14]。

2.2.1.2 加酶量對提油率的影響

在料液比1∶3、pH 8、酶解溫度60℃、酶解時間3 h的條件下，研究加酶量對提油率的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 加酶量對提油率的影響

從圖8可以看出，隨著加酶量的增加，提油率先升高后下降，加酶量為1%時，提油率最高。當(dāng)加酶量過低時，不能將蛋白質(zhì)充分酶解，未完全破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合關(guān)系，魚油不能被充分釋放出來[13]。反之，當(dāng)加酶量過多時，會抑制酶解反應(yīng)速率，從而使得提油率降低。

2.2.1.3 pH對提油率的影響

在料液比1∶3、加酶量0.2%、酶解溫度60℃、酶解時間3 h的條件下，研究pH對提油率的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 pH對提油率的影響

每一種酶都有其最適pH范圍，超過這一范圍，都不能充分體現(xiàn)酶的活性，甚至?xí)斐擅傅牟豢赡嫘允Щ?，還會影響酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)[15]。從圖9可以看出，在pH 8時，提油率最高。在pH 8條件下，酶活最強，酶分子與底物蛋白質(zhì)分子快速結(jié)合，從而較好地破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合，使魚油釋放出來。

2.2.1.4 酶解時間對提油率的影響

在料液比1∶3、加酶量0.2%、pH 8、酶解溫度60℃的條件下，研究酶解時間對提油率的影響，結(jié)果見圖10。

圖10 酶解時間對提油率的影響

從圖10可以看出，酶解反應(yīng)前2 h內(nèi)，提油率增大較明顯。當(dāng)酶解時間超過2 h，提油率趨于平緩。這主要是由于隨著酶解時間延長，酶與底物反應(yīng)較完全，破壞脂肪和蛋白質(zhì)的結(jié)合，釋放出脂肪分子[15]。但隨著酶解時間延長，提油率逐漸趨于平緩。從工作效率、節(jié)約能源等角度考慮，酶解時間2 h 較為合適。

2.2.1.5 酶解溫度對提油率的影響

在料液比1∶3、加酶量0.2%、pH 8、酶解時間3 h 的條件下，研究酶解溫度對提油率的影響，結(jié)果見圖11。

圖11 酶解溫度對提油率的影響

酶屬于生物大分子，酶解溫度過高或過低，都會抑制酶的活性，只有在最適溫度下，酶活最強[16]。從圖11可以看出，隨著酶解溫度的升高，提油率先增大后減小，在酶解溫度為60℃時，提油率最高。這是因為酶解溫度的升高有助于提高酶解體系內(nèi)分子的熱運動，從而使得酶可以更快更好地與底物結(jié)合[17]。當(dāng)酶解溫度超過60℃時，溫度過高，影響了酶的穩(wěn)定性，酶解效果變差。

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以料液比(A)、加酶量(B)、pH(C)、酶解溫度(D)、酶解時間(E)為因素，提油率為指標(biāo)設(shè)計正交試驗。酶解法提取羅非魚魚油正交試驗因素水平見表3，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 酶解法提取羅非魚魚油正交試驗因素水平

表4 酶解法提取羅非魚魚油正交試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表4

試驗號ABCDE空列提油率/%1011332222．621112113324．511213221125．741321231320．251422312126．731523123215．731631323117．641732131220．821833212318．06k124．1522．0021．0924．1123．1521．21k220．6921．7620．9720．9921．9222．20k319．5020．5822．2719．2319．2720．93R04．6501．4201．3004．8803．8801．27

由表4可知，影響提油率的主次因素順序為Dgt;Agt;Egt;Bgt;C。羅非魚魚油的最佳提取方案為A1B1C3D1E1，即料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解溫度55℃、酶解時間2 h。各因素的R值均大于空列的R值，故各因素水平效應(yīng)的差異是存在的。在最佳試驗條件下，進行2次平行驗證試驗，提油率為(28.91±0.18)%。

2.3 兩種方法提取的羅非魚魚油脂肪酸組成(見表5)

表5 兩種方法提取的羅非魚魚油脂肪酸組成及含量 %

注：“-”表示未檢出。

由表5可知,稀堿水解法提取的羅非魚魚油中飽和脂肪酸含量為(31.610±4.740)%，單不飽和脂肪酸含量為(39.899±4.356)%，n-3多不飽和脂肪酸含量為(5.192±0.280)%，而DHA與EPA總含量為2.225%；酶解法提取的羅非魚魚油中飽和脂肪酸含量為(34.396±0.592)%，單不飽和脂肪酸含量為(37.456±0.160)%，n-3多不飽和脂肪酸含量為(4.991±0.099)%，其中DHA與EPA總含量為2.135%。結(jié)果表明兩種提取方法對羅非魚魚油脂肪酸的組成和含量略有影響，但飽和脂肪酸都以棕櫚酸為主，不飽和脂肪酸都以油酸和亞油酸為主，DHA和EPA的含量幾近相同。王倩倩等[15]通過GC-MS對羅非魚內(nèi)臟魚油的脂肪酸組成進行研究，結(jié)果表明主要脂肪酸為棕櫚酸、油酸、亞油酸，與本試驗分析結(jié)果一致，但含量略有差異，這可能是由于羅非魚體內(nèi)的脂肪隨產(chǎn)地和季節(jié)而變化，而且本試驗研究的是羅非魚整魚的脂肪酸，王倩倩等[15]研究的是內(nèi)臟脂肪，這也是脂肪酸含量不一致的原因之一。

3 結(jié) 論

本試驗以凍干羅非魚粉為原料，采用干重法計算提油率，相比濕重法，具更廣泛的應(yīng)用性。通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化了稀堿水解法和酶解法提取羅非魚魚油的最佳工藝條件。得到稀堿水解法提取羅非魚魚油的最佳工藝條件為料液比1∶3、pH 7.5、水解時間30 min、鹽析量2.5%、鹽析時間25 min、水解溫度65℃，在此條件下提油率為(32.13±0.07)%；酶解法提取羅非魚魚油最佳工藝條件為料液比1∶3、加酶量0.6%、pH 9、酶解溫度55℃、酶解時間2 h，在此條件下提油率為(28.91±0.18)%。稀堿水解法的提油率略高于酶解法的。

稀堿水解法提取的羅非魚魚油n-3多不飽和脂肪酸含量為(5.192±0.280)%，略高于酶解法的(4.991±0.099)%。說明稀堿水解法提取的魚油營養(yǎng)價值較酶解法略好。

綜上所述，稀堿水解法相較于酶解法，更適合羅非魚魚油的提取。

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Extractionoffishoilfromtilapiabyhydrationmethodandfattyacidcompositionanalysis

LI Xue, CAO Jun, BAI Xinpeng， JIANG Zefang, LIU Shaojie, LI Ning
(Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Food Development，College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China)

Fish oil was extracted by enzymatic hydrolysis method and diluted alkaline hydrolysis method respectively using tilapia as raw material. The optimal extraction processes of the two hydration methods were determined by single factor experiment and orthogonal experiment. Fatty acid compositions of fish oils were analyzed by GC. The results showed that the optimal extraction conditions of fish oil by diluted alkaline hydrolysis method method were obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶3, pH 7.5, hydrolysis time 30 min, salt dosage 2.5%, salting out time 25 min, hydrolysis temperature 65℃.The optimal extraction conditions of fish oil by enzymatic hydrolysis method were obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶3, enzyme dosage 0.6%, pH 9, enzymatic hydrolysis temperature 55℃, enzymatic hydrolysis time 2 h. Under the optimal conditions, the oil extraction rate andn-3 unsaturated fatty acid content of diluted alkaline hydrolysis method were (32.13±0.07)% and (5.192±0.280)% respectively, higher than those of enzymatic hydrolysis method((28.91±0.18)%, (4.991±0.099)%).

tilapia; fish oil; enzymatic hydrolysis method; diluted alkaline hydrolysis method; fatty acid

2017-03-19；

2017-07-18

海南省高等學(xué)?？蒲许椖?Hnky2016ZD-1)；海南大學(xué)科研啟動基金項目(kyqd1608)

李 雪(1991)，女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與功能食品(E-mail)crystal_lixue@126.com。

曹 君，講師，博士(E-mail)juncaoyd2007@126.com；白新鵬，教授，博士(E-mail)xinpeng2001@126.com。

油脂加工

TS225.2;TQ645.6

A

1003-7969(2017)10-0005-07