孫 月 李鴻利 王禹雪 楊寒凝 朱桂敏 陸永萍
攜IL-8單抗靶向超聲微泡對損傷心肌細(xì)胞的體外尋靶實驗研究
孫 月 李鴻利 王禹雪 楊寒凝 朱桂敏 陸永萍
目的 制備攜IL-8單克隆抗體(以下簡稱單抗)靶向超聲微泡,檢測其基本特性,并探討其對損傷心肌細(xì)胞的體外黏附能力。方法 采用共價偶聯(lián)法制備攜IL-8單抗靶向超聲微泡,利用缺氧、缺糖方法制備損傷心肌細(xì)胞,通過靶向超聲微泡與損傷心肌細(xì)胞的體外結(jié)合實驗檢測其尋靶能力,并與SonoVue微泡進行比較。結(jié)果 攜IL-8單抗靶向微泡與輕度及重度損傷心肌細(xì)胞的黏附比分別為(61.9±18.9)%和(86.6±5.1)%,明顯高于SonoVue微泡與輕度損傷及重度損傷心肌細(xì)胞的黏附比[(12.0±0.6)%和(11.8±1.0)%],差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.01);且隨著損傷程度的加重,攜 IL-8單抗靶向超聲微泡與心肌細(xì)胞的黏附作用逐漸加強(r=0.945,P<0.01)。結(jié)論 攜IL-8單抗靶向超聲微泡對損傷心肌細(xì)胞具有較強的靶向性。
白細(xì)胞介素8;靶向;超聲微泡;損傷心肌細(xì)胞
在我國,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已經(jīng)逐漸成為死亡的最主要原因,致死率、致殘率高。AMI由于冠狀動脈急性閉塞導(dǎo)致部分心肌缺血、壞死及炎細(xì)胞浸潤。白細(xì)胞介素8(IL-8)作為免疫和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,可通過介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞遷移和釋放氧自由基、蛋白分解酶等毒性產(chǎn)物損傷心肌細(xì)胞,在AMI中發(fā)揮重要作用。本實驗采用交聯(lián)劑將抗IL-8單克隆抗體(以下簡稱單抗)偶聯(lián)至SonoVue微泡表面,制備靶向超聲微泡,并將其作用于損傷心肌細(xì)胞,探討攜IL-8單抗靶向超聲微泡對損傷心肌細(xì)胞的體外尋靶能力,為AMI提供新的治療靶點。
一、主要試劑與儀器
鼠抗人 IL-8單抗(英國劍橋 Abcam公司);SonoVue(意大利Bracco公司);羊抗鼠IgG血清(美國KPL公司);熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG血清(IgG-FITC,美國Invitrogen公司);3-(2-吡啶二羥基)丙酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(SPDP,德國Merck公司);H9c2新生大鼠原代心肌細(xì)胞(深圳白恩維生物科技有限公司)。IEC-Multi型常溫高速離心機(德國Sigma公司);倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。
二、靶向超聲微泡的制備
將鼠抗人IL-8單抗溶于緩沖溶液,加入SPDP溶液反應(yīng),離心、洗滌得到帶吡啶二硫基的單抗;加入1 ml的DTT醋酸溶液反應(yīng),離心、洗滌得到帶巰基的抗體溶液。取SonoVue懸液加入SPDP交聯(lián)劑,洗滌后與帶巰基的抗體溶液混合,再次反應(yīng)、洗滌,得到攜IL-8 單抗的超聲微泡懸液[1]。
三、基本特性檢測及免疫熒光染色檢驗
取制備好的靶向超聲微泡與SonoVue微泡各20μl,分別經(jīng)PBS緩沖液稀釋成1 ml均勻分布的懸浮液,各取10 μl懸浮液滴于載玻片,壓片后置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察兩種超聲微泡的性狀、大小、形態(tài)及分散度。另取1 ml靶向超聲微泡與SonoVue微泡分別經(jīng)PBS緩沖液稀釋至5 ml,各加入10 μl鼠抗人IL-8單抗,常溫孵育2 h,經(jīng)PBS液3次洗滌、離心后,加入10 μl標(biāo)記異硫氰光熒光素的羊抗鼠IgG,4℃孵育1 h,經(jīng)PBS緩沖液洗滌、離心,熒光顯微鏡下觀察兩種超聲微泡的免疫熒光染色情況。
四、體外細(xì)胞尋靶實驗
1.損傷心肌細(xì)胞模型的制備:體外培養(yǎng)新生大鼠H9c2原代心肌細(xì)胞,取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于40個35 mm的培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿接種1×105個心肌細(xì)胞。向培養(yǎng)皿中加入高糖培養(yǎng)基,放入無菌培養(yǎng)箱中適應(yīng)1 h后取出。分為實驗組(缺氧、缺糖)和對照組(有氧高糖),實驗組再分為A、B組,對照組分為C、D組,每組10個培養(yǎng)皿。其中A、B組加入低糖培養(yǎng)基,C、D組加入高糖培養(yǎng)基,放入無菌培養(yǎng)箱中適應(yīng)1 h后,將A、B組培養(yǎng)皿放置于氮氣的無氧袋中,使心肌細(xì)胞在純氮氣袋中缺氧、缺糖6 h后取出。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察實驗組和對照組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。
2.心肌細(xì)胞損傷程度分級標(biāo)準(zhǔn)[2]:①正常心肌細(xì)胞(-):飽滿,呈圓形、梭形及錐形,折光性好;②輕度損傷心肌細(xì)胞(+):形態(tài)不規(guī)則,部分細(xì)胞膜破裂,部分可見胞漿顆粒,細(xì)胞間偶聯(lián)破壞,折光性尚可;③重度損傷心肌細(xì)胞(++):細(xì)胞皺縮,細(xì)胞膜破裂,胞漿顆粒增加,細(xì)胞間偶聯(lián)破壞,足突消失,折光性下降。
3.超聲微泡與心肌細(xì)胞相互作用的觀察:實驗組缺氧、缺糖損傷6 h后,同時取出4組培養(yǎng)皿,A、C組加入6×109/ml SonoVue微泡100μl,B、D組加入6×109/ml自制的攜IL-8單抗靶向超聲微泡100 μl;室溫靜置5 min,使微泡與心肌細(xì)胞表面充分接觸;再將微泡懸液吸出,PBS緩沖液清洗細(xì)胞5次,于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組培養(yǎng)皿中心肌細(xì)胞與超聲微泡的黏附作用,并隨機拍攝圖片,每個培養(yǎng)皿5張。統(tǒng)計每張圖片中黏附于超聲微泡的各型心肌細(xì)胞數(shù)及各型心肌細(xì)胞的總數(shù),計算超聲微泡黏附各型心肌細(xì)胞數(shù)占各型心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比即細(xì)胞黏附比。
五、統(tǒng)計學(xué)處理
應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以x±s表示,實驗組和對照組超聲微泡與心肌細(xì)胞黏附作用比較行獨立樣本t檢驗;兩種超聲微泡與各型心肌細(xì)胞的黏附作用與心肌細(xì)胞損傷程度的關(guān)系采用Spearman線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
一、兩種超聲微泡基本特性檢測及免疫熒光染色檢驗結(jié)果
肉眼觀察:所制備的攜IL-8單抗靶向超聲微泡外觀呈均勻的凝乳狀混懸液;倒置光學(xué)顯微鏡下觀察微泡分布均勻,形態(tài)規(guī)則,90%以上的自制靶向超聲微泡粒徑約2~4 μm,微泡間無成簇及聚集現(xiàn)象,與普通SonoVue微泡比較無明顯改變。未偶聯(lián)SonoVue微泡平均濃度為(6.34±0.60)×109/ml,偶聯(lián)后攜 IL-8 單抗靶向超聲微泡平均濃度為(6.28±0.53)×109/ml,二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示SonoVue微泡表面未見熒光顯現(xiàn),攜IL-8單抗靶向超聲微泡表面可見綠色熒光。見圖1。
二、實驗組和對照組心肌細(xì)胞的分布
1.實驗組(A、B組):重度損傷心肌細(xì)胞約占52%,輕度損傷心肌細(xì)胞約占35%,正常心肌細(xì)胞約占13%。
2.對照組(C、D組):重度損傷心肌細(xì)胞約占2%,輕度損傷心肌細(xì)胞約占13%,正常心肌細(xì)胞約占85%。
圖1 兩種超聲微泡形態(tài)、分布及免疫熒光染色效果圖
三、兩種微泡對心肌細(xì)胞的黏附作用
1.實驗組中,A組可見極少量SonoVue微泡黏附于損傷心肌細(xì)胞表面(圖2);B組可見部分?jǐn)yIL-8單抗靶向超聲微泡黏附于輕度損傷心肌細(xì)胞表面(圖3A),大量攜IL-8單抗靶向超聲微泡黏附于重度損傷心肌細(xì)胞表面(圖3B)。
2.對照組中,C組可見極少量SonoVue微泡黏附于正常心肌細(xì)胞表面(圖4A);D組可見極少量攜IL-8單抗靶向超聲微泡黏附于正常心肌細(xì)胞表面(圖4B)。
圖3 實驗B組攜IL-8單抗靶向超聲微泡與輕度及重度損傷心肌細(xì)胞的黏附作用
圖4 對照組SonoVue及攜IL-8單抗靶向超聲微泡與正常心肌細(xì)胞的黏附作用
四、實驗組兩種超聲微泡與各型心肌細(xì)胞黏附作用的定量分析
實驗B組攜IL-8單抗靶向超聲微泡與輕度及重度心肌細(xì)胞黏附比明顯高于實驗A組SonoVue微泡與輕度及重度心肌細(xì)胞黏附比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P<0.01),見表 1;且隨著損傷程度的加重,攜 IL-8單抗靶向超聲微泡與心肌細(xì)胞的黏附作用逐漸加強(r=0.945,P<0.01)。見圖 5。
表1 實驗組兩種超聲微泡與各型心肌細(xì)胞黏附比比較(x±s) %
圖5 實驗組兩種微泡與各型心肌細(xì)胞黏附比與心肌細(xì)胞損傷程度的相關(guān)性散點圖
隨著靶向超聲造影的發(fā)展,其在心血管疾病的診斷價值彌補了CT、MRI及常規(guī)超聲檢查的局限性,為疾病的靶向早期診斷提供了新的手段[3]?!把装Y、損傷”已成為心血管領(lǐng)域的一個研究熱點,炎癥反應(yīng)可激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,黏附及吞噬攜帶相關(guān)炎癥因子的靶向超聲微泡,通過靶向造影發(fā)現(xiàn)炎癥發(fā)生的部位[4]。IL-8是參與AMI重要的炎癥因子,具有強有力的趨化性和促炎作用,可介導(dǎo)激活的中性粒細(xì)胞黏附和運動[5]。本實驗將抗IL-8單抗作為靶向抗體偶聯(lián)至SonoVue微泡表面,并通過體外實驗驗證了其良好的靶向作用和超聲成像特性,為靶向超聲造影早期診斷AMI奠定了基礎(chǔ)。
本實驗結(jié)果表明,經(jīng)過SPDP交聯(lián)后,SonoVue微氣泡大小、形態(tài)及形狀無顯著改變,即其物理、生物性狀未發(fā)生改變,可作為造影劑作用于生物體內(nèi)。羊抗鼠IgG血清作為二抗可以與一抗(鼠抗人IL-8單克隆抗體)發(fā)生凝集反應(yīng),從而證實微泡中存在鼠抗人IL-8單抗。免疫熒光檢驗結(jié)果顯示:自制攜IL-8單抗靶向超聲微泡混懸液與二抗混合反應(yīng)后發(fā)生了明顯的凝集反應(yīng),未偶聯(lián)的Sono Vue微泡無陽性結(jié)果,說明IL-8單抗已成功偶聯(lián)到微泡外殼表面。
本實驗采用缺氧、缺糖法建立損傷的心肌細(xì)胞模型,H9c2心肌細(xì)胞從大鼠胚胎心肌組織分離,生長傳代性質(zhì)穩(wěn)定,已廣泛應(yīng)用于與心肌細(xì)胞相關(guān)的實驗研究[6]。據(jù)文獻[7]報道,缺氧誘導(dǎo) H9c2 心肌細(xì)胞,可使IL-8等炎癥因子表達水平顯著升高。于高倍顯微鏡下(×400)直接觀察普通及自制靶向微泡分別與正常、輕度及重度損傷心肌細(xì)胞的結(jié)合作用,并通過計數(shù)多個高倍視野下黏附微泡的心肌細(xì)胞數(shù),對靶向黏附作用進行定量分析、比較。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,攜IL-8單抗靶向超聲微泡黏附細(xì)胞數(shù)與心肌細(xì)胞損傷程度顯著相關(guān)(r=0.945,P<0.01),隨著心肌細(xì)胞損傷程度的加重,攜IL-8單抗靶向超聲微泡黏附心肌細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加。其原因可能為損傷致使心肌細(xì)胞活化分泌IL-8,損傷越重,則分泌的IL-8越多。同時也說明通過缺氧、缺糖處理可成功誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞分泌IL-8。攜IL-8單抗靶向超聲微泡與損傷心肌細(xì)胞的黏附作用顯著高于普通SonoVue微泡(P<0.01),而與正常心肌細(xì)胞的黏附作用比較中,兩種微泡間無明顯差異。由此可見,靶向性超聲微泡的特異性及敏感性明顯高于普通超聲微泡,為進一步的在體實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
綜上所述,本實驗采用共價偶聯(lián)法通過SPDP交聯(lián)劑將IL-8單抗偶聯(lián)至SonoVue微泡表面,制備出攜特異性抗體的超聲微泡;且體外實驗觀察發(fā)現(xiàn)其與輕度及重度損傷心肌細(xì)胞黏附作用強于普通SonoVue微泡,為靶向超聲造影早期診斷AMI奠定了理論基礎(chǔ)。
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Experimental study on interleukin-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles targeting to injured cardiomyocytes in vitro
SUN Yue,LI Hongli,WANG Yuxue,YANG Hanning,ZHU Guimin,LU Yongping
Department of Ultrasound,the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650021,China
Objective To prepare interleukin-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles,determine the basic characteristies,and investigate their adhesion ability to injured cardiomyocytes in vitro.Methods IL-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles agent was prepared using covalent coupling method,and injured cardiomyocytes were prepared using cellular oxygen/glucose deficiency method.The targeting capacity of the microbubbles agent was assessed by combining targeted ultrasound microbubbles with injured cardiomyocytes in vitro,and the results was compared with SonoVue microbubbles.Results The adhesion ratio of IL-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles to early injured and injured cardiomyocytes was(61.9±18.9)%and(86.6±5.1)%,respectively.The effect was significantly higher than those of SonoVue microbubbles with the adhesion ratio of(12.0±0.6)%and(11.8±1.0)%,respectively,the difference was statistically significant(P<0.01).With the increase of injury severity,the adhesion of IL-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles and cardiomyocytes was gradually enhanced(r=0.945,P<0.01).Conclusion IL-8 monoclonal antibody-targeted ultrasound microbubbles has strong targeting performance to injured cardiomyocytes.
Interleukin-8;Targeted;Ultrasound microbubbles;Injured cardiomyocytes
R-33
A
國家自然科學(xué)基金項目(81460062、81660084);云南省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才培養(yǎng)基金項目(L-201616)
650021 昆明市,昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院云南省第二人民醫(yī)院超聲科
陸永萍,Email:luyongp@163.com
2017-06-21)