程傳東， 牛朝詩， 董永飛， 牛萬祥， 楊 洋

安徽省立醫(yī)院神經(jīng)外科，腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室，安徽省腦立體定向神經(jīng)外科研究所，合肥 230001

HAUSP表達水平對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響*

程傳東， 牛朝詩△， 董永飛， 牛萬祥， 楊 洋

安徽省立醫(yī)院神經(jīng)外科，腦功能與腦疾病安徽省重點實驗室，安徽省腦立體定向神經(jīng)外科研究所，合肥 230001

目的探討調(diào)控皰疹病毒相關(guān)泛素特異性蛋白酶(HAUSP)對膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的影響。方法構(gòu)建HAUSP過表達及低表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U87、U251細胞，上調(diào)或下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中HAUSP表達水平。熒光定量PCR、Western blot檢測膠質(zhì)瘤細胞中HAUSP mRNA和蛋白表達水平；利用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞增殖水平；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化。同時檢測各組細胞NANOG mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果成功構(gòu)建穩(wěn)定HAUSP過表達和低表達U87、U251細胞株；與空白對照組相比，HAUSP過表達組細胞中，HAUSP的mRNA、蛋白水平均明顯增加，NANOG mRNA水平無明顯變化，但NANOG蛋白水平增加，同時細胞增殖能力增強，細胞凋亡水平降低；與空白對照組相比，HAUSP干擾組細胞中，HAUSP的mRNA、蛋白水平表達均降低，NANOG mRNA水平無明顯變化，但NANOG蛋白水平降低，同時細胞增殖能力減弱，細胞凋亡水平增加。結(jié)論HAUSP過表達可促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖，這一過程中伴隨著NANOG蛋白水平的增高。因此，HAUSP可能通過維持NANOG去泛素化狀態(tài)而維持膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤； HAUSP； NANOG； 去泛素化； 腫瘤干細胞

皰疹病毒相關(guān)泛素特異性蛋白酶(HAUSP)基因定位于人染色體16p13.3，HAUSP蛋白是泛素特異性修飾酶家族成員之一，可維持底物蛋白去泛素化狀態(tài)，是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)器，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1-2]。HAUSP通過去泛素化作用參與蛋白水平調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌蛋白或癌蛋白角色，可因不同的細胞亞群或組織類型而呈現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HAUSP在腦膠質(zhì)瘤組織中表達增多，與膠質(zhì)瘤細胞的增殖及低分化狀態(tài)有密切相關(guān)性，且與NANOG有共同亞細胞定位[3-5]。為進一步闡明HAUSP-NANOG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)活性的關(guān)系，我們以膠質(zhì)瘤細胞為基礎(chǔ)，通過改變HAUSP表達水平，探討HAUSP-NANOG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 U87與U251細胞的培養(yǎng)

U87及U251膠質(zhì)瘤細胞株購自中科院上海細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1∶11)培養(yǎng)液中，常規(guī)換液，細胞生長至70%～80%匯合時進行傳代培養(yǎng)。

1.2 材料與試劑

兔抗人HAUSP多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗人NANOG單克隆抗體(Abcam公司)，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)，Trizol(Invitrogen公司)，蛋白Marker、實時熒光定量PCR試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司)，超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、細胞增殖檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，引物均由上海生工公司合成；其它常規(guī)試劑為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 過表達或低表達HAUSP質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

收集各組對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液密度至1×105/mL。于96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，5%CO2，37℃孵育18 h，棄培養(yǎng)上清，無血清培養(yǎng)液Opti-MEM洗1次，加入轉(zhuǎn)染試劑、過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染實驗。成功建立穩(wěn)定過表達和低表達HAUSP的U87、U251細胞株，熒光顯微鏡下觀察可見所有細胞均穩(wěn)定表達GFP熒光。根據(jù)HAUSP基因的序列(NM_001286457)，設(shè)計了2條干擾序列，GCCCGGTAATATGTCTCATCC(3397)和GCACCATACCC-AAATTATTCC(1152)，包裝慢病毒后轉(zhuǎn)染細胞，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。通過抗性篩選(puromycin)，獲得穩(wěn)定表達所攜帶基因的U251-1152、U251-3397、U251-HAUSP-O和U251-NC，以及U87-1152、U87-3397、U87-HAUSP-O和U87-NC細胞(圖1)。

圖1 構(gòu)建穩(wěn)定的HAUSP過表達和低表達細胞系(×40)Fig.1 Construction of stable HAUSP overexpression and low expression cell lines (×40)

1.4 定量PCR實驗

收集各組細胞，Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光儀檢測RNA的純度及含量，調(diào)整RNA濃度為1 μg/μL。用Prime Script?反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。HAUSP引物：上游5′-ATGAACCACCAGCAGCAGCAGC-3′，下游5′-GCGTGGCATCACCATAATCTTCC-3′，產(chǎn)物長度312 bp；NANOG引物：上游5′-GAGACTGTCTCTCCTCTTCCT-3′，下游5′-CCAGAAGACAAAGAACTGGCC-3′，產(chǎn)物長度150 bp；β-actin引物：上游5′-ATGGATGATGA-TATCGCCGCGCTC-3′，下游5′-TTTCTCCATG-TCGTCCCAGTTGG-3′，產(chǎn)物長度252 bp。按試劑盒要求，配置反應(yīng)體系，PCR擴增，擴增方法及計算方法按照前期實驗進行[3]。

1.5 Western blot檢測

收集各組細胞，提取總蛋白，紫外分光法蛋白定量。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入一抗兔抗人HAUSP多克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗人NANOG單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，次晨加二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，ECL染色5 min，膠片曝光顯影，結(jié)果用Quanlity One分析，GAPDH為內(nèi)對照，以目的條帶與內(nèi)參的灰度值比表示其相對表達量。

1.6 細胞增殖試驗

細胞轉(zhuǎn)染病毒24～96 h后，將空白對照組、HAUSP過表達組、HAUSP干擾組膠質(zhì)瘤細胞制備成單細胞懸液(2×104/mL)，將100 μL細胞懸液加入96孔板一孔中，每組設(shè)3個復(fù)孔，隨后分別在24、48、72、96 h 4個時間點加入CCK-8(10 μL)，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別用酶標儀在24、48、72、96 h 4個時間點檢測膠質(zhì)瘤細胞的吸光度(A)值。

1.7 細胞周期檢測

膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染病毒48～72 h后，移液槍吸去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每次5 min，再用0.25%胰酶消化細胞，使細胞從培養(yǎng)皿上脫落，顯微鏡下觀察到大部分細胞脫落后，加入全細胞培養(yǎng)液4 mL并輕輕吹打細胞，再次將細胞懸液收集到離心管中，然后1 000 r /min離心5 min，吸去上清液，加入2 mL溫浴PBS，重懸細胞，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，再次離心，加入冰浴預(yù)冷70%乙醇2 mL，輕輕吹打混勻制成細胞懸液，在4℃條件下固定12～24 h。細胞固定后每管樣品中加入25 μL碘化丙啶染色液(20×)，0.5 mL染色緩沖液和10 μL RNase A(50×)，輕輕地吹打細胞，37℃避光溫浴30 min，隨后放置4℃或冰浴避光保存。然后用流式細胞儀在450 nm波長處檢測熒光，同時檢測光反射情況。

1.8 細胞凋亡實驗

將轉(zhuǎn)染病毒48 h后的膠質(zhì)瘤細胞用胰酶消化，PBS清洗2遍，將細胞密度調(diào)節(jié)為(1～5)×105/mL，用1×binding buffer 100 μL懸浮細胞后，分別加入5 μL 7-AAD和5 μL PE染料混勻。室溫避光反應(yīng)10～15 min后加入1×binding buffer 400 μL來懸浮細胞，再用流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以百分數(shù)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中HAUSP及NANOG mRNA的表達

與空白對照組相比，HAUSP過表達組中HAUSP mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.01)，HAUSP干擾組中HAUSP的mRNA水平明顯下降(P<0.01)(圖2)；與空白對照組相比，HAUSP過表達組中NANOG mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，HAUSP干擾組中NANOG mRNA表達亦無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

與空白對照組(NC)比較，*P<0.05 **P<0.01圖2 各組細胞中HAUSP mRNA表達水平Fig.2 HAUSP mRNA expression levels in each group

圖3 各組細胞中NANOG mRNA表達水平Fig.3 NANOG mRNA expression levels in each group

2.2 各組細胞中HAUSP、NANOG蛋白表達水平

與空白對照組相比，HAUSP過表達組中HAUSP、NANOG的蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)，兩者的上升趨勢呈現(xiàn)一致；與空白對照組相比，HAUSP干擾組中HAUSP、NANOG的蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，兩者的下降趨勢呈現(xiàn)一致(圖4)。

2.3 各組細胞增殖能力

分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h比較各組細胞的增殖能力。在24 h和48 h時間點，3組細胞增殖能力無明顯差異(P>0.05)；在72 h和96 h時間點，HAUSP過表達組的細胞增殖能力較空白對照組明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HAUSP干擾組的細胞增殖能力于96 h時間點較空白對照組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

2.4 各組細胞的細胞周期

相對于空白對照組，HAUSP過表達組細胞表現(xiàn)出明顯的周期停滯(S期細胞比例增加)，而干擾HAUSP表達會推進細胞周期的進程(G2/G1期細胞比例顯著增加)(圖6)。

2.5 各組膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率

通過流式細胞儀檢測空白對照組、HAUSP過表達組和干擾組的膠質(zhì)瘤細胞凋亡率。檢測結(jié)果顯示HAUSP過表達組的膠質(zhì)瘤細胞比對照組細胞有更低的凋亡率，而下調(diào)HAUSP的表達可促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡(圖7)。

與空白對照組(NC)比較，*P<0.05 **P<0.01圖4 各組細胞中HAUSP、NANOG蛋白的表達水平Fig.4 Expression levels of HAUSP and NANOG protein in each group

與空白對照組(NC)比較，*P<0.05 **P<0.01圖5 各組細胞增殖能力Fig.5 Cell proliferation in each group

圖6 各組細胞的細胞周期Fig.6 Cell cycle in each group

與空白對照組(NC)比較，*P<0.05 **P<0.01圖7 各組膠質(zhì)瘤細胞的凋亡率Fig.7 Apoptosis rate of glima cells in each group

3 討論

膠質(zhì)瘤目前仍是死亡率較高的惡性腫瘤之一，由于其惡性增殖和侵襲性生長的特性，復(fù)發(fā)率、死亡率高，預(yù)后差，因此無論是手術(shù)治療，還是放療、化療，都無法徹底治愈[6-7]。隨著腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)研究的深入，目前已成功從膠質(zhì)瘤組織和細胞系中分離鑒定出膠質(zhì)瘤干細胞，并認為膠質(zhì)瘤干細胞與膠質(zhì)瘤的惡性程度、耐藥性、復(fù)發(fā)和侵襲性生長密切相關(guān)[8-10]。而轉(zhuǎn)錄因子在維持干細胞全能性中起核心作用，直接決定干細胞分化與否，在腫瘤的惡性進展中起到關(guān)鍵性作用，因此，精確調(diào)控維持干細胞多向分化潛能的轉(zhuǎn)錄因子的功能至關(guān)重要。

HAUSP作為去泛素化酶，可介導(dǎo)底物蛋白的去泛素化，影響蛋白的泛素化水平，從而調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性、核定位以及轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，主要可分為p53依賴途徑和p53非依賴途徑。在不同的腫瘤或細胞系中HAUSP介導(dǎo)的去泛素化水平不同，因此表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性[11]。

研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，在人腦膠質(zhì)瘤組織及膠質(zhì)瘤細胞U87中，HAUSP與NANOG均有表達，兩者表達均與膠質(zhì)瘤級別有關(guān)，且兩者表達具有正相關(guān)性，在膠質(zhì)瘤細胞中兩者具有共同的核定位，提示NANOG作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，與HAUSP相互作用，共同影響腫瘤細胞的增殖，維持腫瘤細胞的干細胞特性。

NANOG的高表達可維持膠質(zhì)瘤細胞的低分化或未分化狀態(tài)[12]。但NANOG蛋白是一個極不穩(wěn)定蛋白，半衰期短，在胚胎干細胞中其可通過泛素-蛋白酶體途徑(UPP)降解，NANOG蛋白的翻譯后泛素化和去泛素化修飾對于其蛋白水平穩(wěn)定性和生物學(xué)活性進行著精確的調(diào)控[13]。HAUSP作為去泛素化酶，能催化水解泛素分子C-末端的肽鏈連接，發(fā)揮去泛素化作用，參與蛋白調(diào)控及影響轉(zhuǎn)錄因子的核定位及降解，尤其可特異性地識別和結(jié)合具有P/AxxS基序的蛋白[13]。通過GenBank檢索NANOG蛋白的氨基酸序列顯示NANOG蛋白具有多個P/AxxS基序，為HAUSP與NANOG可以相互作用提供了蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且分析發(fā)現(xiàn)數(shù)個P/AxxS基序位于NANOG蛋白N-端的PEST序列之內(nèi)。此序列可以介導(dǎo)NANOG蛋白的泛素化使其降解，而PEST序列的缺失可以避免NANOG蛋白的泛素化而穩(wěn)定NANOG蛋白[13-14]。

為進一步探討HAUSP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在膠質(zhì)瘤中的作用，本實驗通過改變HAUSP在膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平研究膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)活性的變化。本實驗結(jié)果顯示：在不同類型膠質(zhì)瘤細胞系中，利用病毒載體轉(zhuǎn)染手段，上調(diào)HAUSP的表達，NANOG蛋白水平上調(diào)，同時伴有細胞增殖能力增強，但NANOG基因的mRNA水平未見明顯變化；反之，下調(diào)HAUSP的表達，NANOG蛋白水平也下調(diào)，同時伴有細胞增殖能力減弱，但NANOG基因的mRNA水平未見明顯變化。結(jié)合前期研究[14-16]表明，HAUSP對腫瘤細胞影響均是通過去泛素化修飾底物蛋白完成，在膠質(zhì)瘤細胞中可能作用于NANOG蛋白來維持細胞的低分化狀態(tài)。具體機制可能是通過HAUSP與NANOG蛋白所具有的P/AxxS基序直接結(jié)合，維持NANOG蛋白的去泛素化狀態(tài)，而避免NANOG蛋白降解，維持膠質(zhì)瘤細胞的低分化狀態(tài)和膠質(zhì)瘤干細胞的多向分化潛能，與膠質(zhì)瘤惡性進展可能密切相關(guān)。

綜上所述，本研究表明調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞中HAUSP的表達可影響腫瘤細胞生物學(xué)活性，HAUSP與特定基序結(jié)合維持NANOG蛋白的去泛素化狀態(tài)，抑制了NANOG蛋白的降解是其可能的作用機制。高水平HAUSP抑制了NANOG蛋白的降解而使膠質(zhì)瘤細胞處于低分化或未分化狀態(tài)，是膠質(zhì)瘤惡性進展的可能因素。因此，抑制HAUSP蛋白去泛素化活性可作為治療腦膠質(zhì)瘤的潛在途徑，同時針對HAUSP與NANOG蛋白的特定結(jié)合基序的研究將成為今后膠質(zhì)瘤研究的新方向。

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EffectsofHAUSPExpressionontheProliferationandApoptosisofGliomaCells

Cheng Chuandong，Niu Chaoshi△，Dong Yongfeietal

DepartmentofNeurosurgery，AnhuiProvincialHospital，AnhuiProvinceKeyLaboratoryofBrainFunctionandBrainDisease，AnhuiProvincialStereotacticNeurosurgicalInstitute，Hefei230001，China

ObjectiveTo investigate the function and possible mechanisms of HAUSP expression on the proliferation and apoptosis of glioma cells.MethodsHAUSP overexpression and low expression plasmids were constructed and transfected U87 and U251 cell lines by virus vector.Real-time reverse-transcription PCR and Western blotting were utilized to detect mRNA levels and protein expression of HAUSP and NANOG in theglioma cells，respectively.The abilities of cellular proliferation and apoptosis were measured by mosmanntetrazolium test(MTT)assay and flow cytometry(FCM).ResultsHAUSP overexpression and low expression U87 and U251 cell lines were constructed successfully.In HAUSP overexpression group，we found an obvious increase in the mRNA and protein expression levels of HAUSP compared to the control group.Simultaneously，the mRNA of NANOG was not significantly different，but NANOG protein increased obviously，which increased the proliferation of glioma cells and reduced the apoptosis of those cells.In HAUSP lowexpression group，we found an obvious decrease in the mRNA and protein expression level of HAUSP as compared to the control group.Simultaneously，the mRNA of NANOG was not significantly different，but NANOG protein decreased obviously，which decreased the proliferation of glioma cells and increased the apoptosis of those cells.ConclusionHAUSP overexpression can promote the proliferation of glioma cells and increase NANOG protein level.Therefore，HAUSP may maintain the proliferation activity of glioma cells by maintaining deubiquitination of NANOG.

glioma； HAUSP； NANOG； deubiquitinating； cancer stem cell

*安徽省自然科學(xué)基金青年項目(No.1508085QH184)

程傳東，男，1985年生，主治醫(yī)師，博士研究生，E-mail：doctorcd@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：niuchaoshi@126.com

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.004

(2017-08-23 收稿)