謝 樂(lè) 毛榮軍 韓福蘭

廣東省佛山市中醫(yī)院病理科，廣東佛山 528000

Clusterin與乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

謝 樂(lè) 毛榮軍 韓福蘭

廣東省佛山市中醫(yī)院病理科，廣東佛山 528000

目的考察Clusterin在乳腺癌中的表達(dá)情況，以及Clusterin與淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。方法選取我院2015年6月～2016年6月經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者55例，31例乳腺癌良性病例患者，21例癌旁組織3cm作為對(duì)照組。免疫組化SP法檢測(cè)Clusterin和D2-40蛋白表達(dá)水平，計(jì)算微淋巴管密度。結(jié)果Clusterin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)；乳腺癌組織中Clusterin陽(yáng)性率顯著高于乳腺良性組織和癌旁組織（P＜0.05）；乳腺癌組織中MLVD顯著高于乳腺良性組織和癌旁組織（P＜0.05）；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Clusterin陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.882，P＜0.05）。結(jié)論乳腺癌患者Clusterin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Clusterin表達(dá)陽(yáng)性率上升。

Clusterin；乳腺癌；淋巴道轉(zhuǎn)移；相關(guān)性

R736.3

A

2095-0616（2018）01-194-04

Correlation between Clusterin and lymphatic metastasis of breast cancer

XIE Le MAO Rongjun HAN Fulan
Department of Pathology, Foshan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Foshan 528000, China

ObjectiveTo investigate the expression of Clusterin in breast cancer,correlation between Clusterin and lymphatic metastasis.MethodsFrom June 2015 to June 2016, 55 cases of breast cancer patients , 31 cases of benign breast cancer patients, 21 cases of 3cm adjacent cancer tissue as control group. The expression levels of Clusterin and D2-40 were detected by immunohistochemical SP method, and the density of lymphatic vessels was calculated.ResultsClusterin was mainly expressed in the cytoplasm; The positive rate of Clusterin in breast cancer was significantly higher than that in benign breast tissue andparacancerous tissue(P＜0.05); MLVD in breast cancer was significantly higher than that in benign breast tissue and paracancerous tissue(P＜0.05); The positive rate of Clusterin in patients with lymph node metastasis was higher than that in patients without lymph node metastasis(χ2=7.882,P＜ 0.05).ConclusionThe expression of Clusterin protein in breast cancer patients was upregulated.The positive rate of Clusterin expression in breast cancer patients with lymph node metastasis was increased.

Clusterin; Breast cancer; Lymphatic metastasis; Correlation

近年，乳腺癌發(fā)病率在全球呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家及我國(guó)的一些大城市已成為危害婦女健康乃至生命的第一位惡性腫瘤。全球每年約有130萬(wàn)人被診斷為乳腺癌，約有40萬(wàn)人死于該病。近年來(lái)，乳腺癌在我國(guó)發(fā)病率逐步上升，乳腺癌已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是患者術(shù)后復(fù)發(fā)及死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌的轉(zhuǎn)移主要通過(guò)淋巴道的區(qū)域性淋巴結(jié)播散[2]，但乳腺癌淋巴道擴(kuò)散的分子機(jī)制尚不清楚，但對(duì)其關(guān)鍵因子的研究有助于判斷乳腺癌的預(yù)后和發(fā)生發(fā)展。因此，研究乳腺癌淋巴道擴(kuò)散的分子機(jī)制具有更重要的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2015年6月～2016年6月經(jīng)病理證實(shí)的乳腺癌患者55例。年齡30～83歲，平均（51.1±10.3）歲，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者32例，無(wú)淋巴結(jié)患者23例。組織學(xué)分級(jí)WHO 2003年標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)20例，Ⅲ級(jí)17例。31例乳腺癌良性病例患者，年齡25～79歲，平均（47.9±6.8）歲。取21例癌旁組織3cm作為對(duì)照組，年齡31～78歲，平均（50.2±7.5）歲。三組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究得到佛山市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)和通過(guò)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚度4μm。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Clusterin在乳腺癌、乳腺良性組織及乳腺正常組織中的表達(dá)情況。石蠟切片，片置烤片板上2h；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；PBS漂洗，高壓鍋抗原修復(fù)；PBS漂洗3次，3% H2O2孵育10min，PBS漂洗；一抗孵育1h（1∶500稀釋?zhuān)?；PBS漂洗，二抗孵育15min；PBS漂洗，DAB顯色。以D2-40蛋白免疫組化標(biāo)記微淋巴管密度（MLVD）[3]。

光學(xué)顯微鏡下（400×）隨機(jī)選擇4個(gè)視野，計(jì)算視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比為＜5%為（-）；陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于5%為（+）[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，三組及以上計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析，若結(jié)果陽(yáng)性，則利用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，利用Pearson列聯(lián)系數(shù)計(jì)算分類(lèi)變量關(guān)聯(lián)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Clusterin在乳腺癌中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，Clusterin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，顯示為棕黃色顆粒。癌旁組織未見(jiàn)Clusterin的表達(dá)。乳腺良性組織可少見(jiàn)Clusterin的表達(dá)。見(jiàn)圖1。乳腺癌組織中Clusterin陽(yáng)性率為52.7%，乳腺良性組織中的陽(yáng)性率為12.9%，癌旁組織中Clusterin陽(yáng)性率為0.0%。三組的陽(yáng)性率數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=26.393，P＜0.05），兩兩結(jié)果為乳腺癌組織中Clusterin陽(yáng)性率顯著高于乳腺良性組織和癌旁組織（P＜0.05），乳腺良性組織和癌旁組織中的Clusterin陽(yáng)性率數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見(jiàn)表 1。

表1 Clusterin在乳腺癌中的表達(dá)

2.2 MLVD在乳腺癌中的表達(dá)

乳腺癌組織中MLVD為（17.80±4.03），乳腺良性組織中MLVD為（6.44±2.43），癌旁組織MLVD為（2.01±1.04）。三組MLVD值數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.393，P＜0.05），q檢驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MLVD顯著高于乳腺良性組織，而乳腺良性組織MLVD又顯著高于乳腺正常組織，數(shù)據(jù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

圖1 Clusterin在乳腺癌中的表達(dá)

表2 MLVD在乳腺癌中的表達(dá)（± s）

表2 MLVD在乳腺癌中的表達(dá)（± s）

注：與乳腺癌組織比較，aP＜0.05；與乳腺良性組織比較，bP＜0.05；與癌旁組織比較，cP＜0.05

分組 n MLVD乳腺癌組織bc 55 17.80±4.03乳腺良性組織ac 31 6.44±2.43乳腺正常組織ab 21 2.01±1.04 F 227.88 P＜0.001

2.3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下Clusterin表達(dá)的差異

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中22例Clusterin陽(yáng)性，陽(yáng)性率為68.8%。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中7例Clusterin陽(yáng)性，陽(yáng)性率為30.4%。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Clusterin陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.882，P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下Clusterin表達(dá)的差異

3 討論

目前，針對(duì)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。腫瘤淋巴管新生和淋巴道轉(zhuǎn)移是其研究中的熱點(diǎn)，腫瘤淋巴管可能來(lái)源于淋巴管的出芽生長(zhǎng)或者骨髓的內(nèi)皮細(xì)胞，最新研究顯示腫瘤淋巴管主要來(lái)源于淋巴管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長(zhǎng)后形成，表明瘤內(nèi)及瘤周淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中起著更重要的作用[5]。瘤內(nèi)及瘤周淋巴管生成促進(jìn)腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移可能是：腫瘤細(xì)胞脫落，通過(guò)瘤內(nèi)及瘤周新生淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，向血管外遷移，形成新的轉(zhuǎn)移灶[6]。

本研究中利用MLVD作為對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行描述的參數(shù)，從該指標(biāo)的名稱(chēng)就可以看出，隨著MLVD數(shù)值的增加，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性也逐漸上升。在已經(jīng)報(bào)道的乳腺癌和結(jié)腸癌[7]的研究中，MLVD與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，MLVD升高意味著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的概率增加，同時(shí)也意味著原發(fā)病灶?lèi)夯潭鹊南鄬?duì)提升，因?yàn)橹挥袗夯潭容^高的病灶發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率較高。淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌的惡化的重要因素，本研究中在研究中進(jìn)一步證實(shí)了該過(guò)程，乳腺癌組織中MLVD顯著高于乳腺良性組織和癌旁組織，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且隨著組織癌變程度加大，MLVD的數(shù)值也出現(xiàn)不斷增大的趨勢(shì)，該研究結(jié)果和目前的主流研究一致[8]，也提示淋巴道轉(zhuǎn)移的途徑對(duì)于乳腺癌惡化程度的重要意義，說(shuō)明MLVD衡量乳腺癌惡化程度的敏感度。

Clusterin是一種76～80kDa高度保守的異二聚體分泌型糖蛋白，廣泛分布于人體組織，參與了體內(nèi)多種生理功能，如參與脂類(lèi)交換和運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)補(bǔ)體作用，細(xì)胞保護(hù)作用。人體存在的分泌性Clusterin[9]和核型Clusterin，分泌性Clusterin是生理?xiàng)l件下的主要存在形式，Clusterin具有雙向調(diào)節(jié)的作用，一方面可以發(fā)揮促凋亡的作用，另外一方面可以誘導(dǎo)腫瘤的耐藥性作用。核型Clusterin是一種細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，而分泌型Clusterin則是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。在本研究中，比較了乳腺癌組織，乳腺良性組織和癌旁組織中Clusterin表達(dá)的情況，結(jié)果顯示乳腺癌組織中Clusterin陽(yáng)性率顯著高于乳腺良性組織和癌旁組織（P＜0.05），此結(jié)果提示Clusterin可能在乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起到了重要的促進(jìn)作用。通過(guò)免疫組化的方法，本研究中也發(fā)現(xiàn)Clusterin主要存在于胞漿中。盡管Clusterin在各類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生，發(fā)展中確切的分子機(jī)制尚不清楚，但是在近些年的研究結(jié)果表明，Clusterin可能是通過(guò)抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制直接發(fā)揮促腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到作用，Sintich等[11]認(rèn)為Clusterin及其抗體均為大分子蛋白，不會(huì)直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞膜才是其作用部位，而Kruger等[12]的研究結(jié)果與本研究相類(lèi)似，其結(jié)果為Clusterin表達(dá)的上調(diào)與乳腺?gòu)恼＝M織到癌前病變和乳腺惡性變的進(jìn)展密切相關(guān)。

Clusterin如何促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，是否Clusterin可影響淋巴道轉(zhuǎn)移，目前尚未見(jiàn)Clusterin與淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)報(bào)道，本研究中嘗試分析不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)下Clusterin表達(dá)的差異，結(jié)果顯示，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Clusterin陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.882，P＜ 0.05），但是作為橫斷面研究，尚無(wú)法確定兩者之間的因果關(guān)聯(lián)，只能猜想乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與Clusterin的高表達(dá)有關(guān)，由于目前關(guān)于Clusterin和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的研究較少，尚無(wú)法分析其可能機(jī)制。

綜上所述，乳腺癌患者中Clusterin蛋白表達(dá)水平上調(diào)，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者Clusterin表達(dá)陽(yáng)性率上升，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] 薛書(shū)霞，張景華，李景武，等 .Clusterin、Livin、Caspase-3蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，17（12）：1612-1617.

[2] 李景武，張景華，薛書(shū)霞，等.乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Clusterin蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系[J].腫瘤學(xué)雜志，2012，18（6）：405-407.

[3] Radziwonbalicka A，Santosmartinez MJ，Corbalan JJ，et al.Mechanisms of platelet-stimulated colon cancer invasion:role of clusterin and thrombospondin 1 in regulation of the P38MAPK-MMP-9 pathway[J].Carcinogenesis，2014，35（2）：324-327.

[4] 李義強(qiáng)，趙春雨，李壯，等.乳腺癌微淋巴管生成與淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2012，35（2）：65-66.

[5] Yong Tang，F(xiàn)enghua Liu，Chunning Zheng，et al.Erratum to： Knockdown of clusterin sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine chemotherapy by ERK1/2 inactivation[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research: CR，2012，31（1）：73-77.

[6] 陳鑫.伴有內(nèi)乳區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ⅢC期乳腺癌的預(yù)后分析研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2015：32-40.

[7] 謝曉斌，陳小衛(wèi)，龍捷，等.VEGF-C基因表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌增殖及淋巴轉(zhuǎn)移抑制作用研究[J].中華腫瘤防治雜志，2014，21（22）：1778-1782.

[8] Sujit K Bhutia，Das SK.Mda-7/IL-24 differentially regulates soluble and nuclear clusterin in prostate cancer[J].Journal of Cellular Physiology，2012，227（5）：1805-1809.

[9] Niu ZH，Wang Y，Chun B，et al.Secretory clusterin(sCLU)overexpression is associated with resistance to preoperative neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer[J].European Review for Medical & Pharmacological Sciences，2013，17（10）：1337-1339.

[10] 李陽(yáng).NF-kB、VEGF-C及VEGFR-3在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[D].石家莊：河北聯(lián)合大學(xué)，2014：36-41.

[11] Sintich SM，Steinberg J，Kozlowski JM，et al.Cytotoxic sensitivity to tumor necrosis factor-alpha in PC3 and LNCaP prostatic cancer cells is regulated by extracellular levels of SGP-2(clusterin)[J].Prostate，1999，39（2）：87-93．

[12] Kruger S，Ola V，F(xiàn)ischer D，et a1.Prognostic significance of clusterin immunoreactivity in breast cancer[J].Neoplasma，2007，54（1）：46-50.

2017-09-04）