孫寶華，李方達(dá)，聶浩，劉端，鄭月宏

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100730)

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)非溶酶體通路的蛋白質(zhì)溶解主要途徑，主要由泛素激活酶、泛素交聯(lián)酶、泛素連接酶和26S蛋白酶體組成。泛素是76個(gè)氨基酸組成的高度保守多肽鏈，它存在于所有真核細(xì)胞中, 以游離形式存在或與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的各種蛋白共價(jià)結(jié)合。26S蛋白酶體是一個(gè)由多個(gè)亞單位組成的蛋白酶復(fù)合體，它有兩個(gè)19S具有調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)顆粒，一個(gè)20S具有蛋白酶體催化活性的核心顆粒。19S與多聚泛素鏈結(jié)合使底物蛋白變性, 并協(xié)助底物進(jìn)入蛋白酶體的水解中心。20S圓柱體空心結(jié)構(gòu)中心具有酶活性位點(diǎn), 它可將泛素化的蛋白質(zhì)降解成3～22個(gè)氨基酸殘基的小肽段[1]。這個(gè)20S(700 ku)的圓柱型核心是由28個(gè)亞單位排列成的4個(gè)七聚體環(huán)組成，其外環(huán)由7個(gè)α亞單位組成，內(nèi)環(huán)由7個(gè)β亞單位組成。外環(huán)無(wú)催化活性，內(nèi)環(huán)是催化中心所在的位置，α亞單位被認(rèn)為是主要的結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)區(qū)域，β亞單位是酶促反應(yīng)中心。酶體對(duì)底物作用的特異性取決于β1、β2、β5 亞單位氨基末端蘇氨酸(threonine，Thr)殘基上肽鍵的剪切方式，與β1、β2和β5亞單位對(duì)應(yīng)的蛋白酶分別為糜蛋白酶、胰蛋白酶和半胱天冬氨酸酶[2]。它另外的一種形式是26S蛋白酶體, 包含20S蛋白酶體及調(diào)節(jié)功能活性的亞基。20S蛋白酶體在干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)[3]、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、 一氧化氮等刺激誘導(dǎo)下，其β亞單位的β1、β2 和β5 可相應(yīng)被β1i、β2i和低分子量多肽7(low-molecular-mass proteasome 7,LMP7,β5i) 取代，組裝成新的20S蛋白酶體，因?yàn)棣?i、β2i和LMP7可增強(qiáng)蛋白酶體產(chǎn)生與主要組織容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ類分子相結(jié)合的多肽，新形成的蛋白酶體又稱“免疫蛋白酶體”(immunoproteasome)。其中LMP7(β5i)亞基由275個(gè)氨基酸組成，具有糜蛋白酶樣活性，參與蛋白質(zhì)水解、抗原提呈和免疫反應(yīng)，是免疫蛋白酶體中最重要的活性亞基。

1 LMP7(β5i)的分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性

人類LMP基因位于6p21.3，包含LMP2和LMP7兩個(gè)基因座，又分別稱為PSMB9和PSMB8。LMP7基因有2個(gè)轉(zhuǎn)錄子, 分別編碼蛋白酶體β8亞單位的E1前蛋白(272個(gè)氨基酸)和E2前蛋白(276個(gè)氨基酸)。編碼E1和E2的2個(gè)轉(zhuǎn)錄子都有6個(gè)外顯子, E1的第1外顯子比E2的長(zhǎng)467個(gè)核苷酸，其余5個(gè)外顯子序列相同。E1和E2前蛋白均被降解為含204個(gè)氨基酸的成熟肽。LMP7(β5i)與蛋白酶體其他亞單位基因高度同源，與具有蛋白水解活性的β亞單位一樣，屬于氨基端親核水解酶類超家族。氨基端的第1位為Thr, 第17位為谷氨酸(glutamic acid，Glu)，第33位為賴氨酸(lysine，Lys)。研究表明Thr和Lys為質(zhì)子受體或供體，參與底物水解。Thr為親核基團(tuán),其氧離子通過(guò)與羥基相互吸引發(fā)揮親核攻擊，Glu和Lys位于Thr1附近, 在水解過(guò)程中Glu確保Lys功能正常發(fā)揮。此3個(gè)氨基酸為蛋白酶體活性中心發(fā)揮水解作用所必需。

LMP基因位于MHC基因區(qū)域，其功能與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)。許多研究表明該基因在MHC-Ⅰ類分子抗原提呈過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LMP7是構(gòu)成免疫多功能蛋白酶體20S的活性單位, 參與非溶酶體蛋白水解途徑，可將內(nèi)源性抗原降解為5～15個(gè)氨基酸的短肽，具有糜蛋白酶樣(chymotrpsin-like)活性。內(nèi)源性抗原或變性蛋白泛素化打開(kāi)空間結(jié)構(gòu)后，線形蛋白進(jìn)入LMP調(diào)節(jié)的蛋白酶體中，產(chǎn)生羧基端為堿性或疏水性氨基酸殘基的短肽, 在熱休克蛋白的作用下與抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體(transporter associated with antigen processing，TAP)1和2組成的異二聚體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行氨基端的修飾后與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，經(jīng)高爾基體在細(xì)胞表面共同被CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別, 從而產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，在上述過(guò)程中LMP發(fā)揮重要作用。研究表明[4],羧基末端為堿性及疏水性氨基酸殘基短肽，與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合力較強(qiáng)。無(wú)細(xì)胞因子作用時(shí)，LMP7(β5i)在許多淋巴系來(lái)源的細(xì)胞高表達(dá)，包括抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)和T淋巴細(xì)胞，此種表達(dá)稱為組成型表達(dá)。此外，LMP7(β5i)的表達(dá)還可在IFN-γ、TNF-α及熱休克蛋白誘導(dǎo)下上調(diào)，其中IFN-γ是最強(qiáng)的誘導(dǎo)因子，它通過(guò)與基因的IFN調(diào)節(jié)因子1相互作用而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。然而，Momburg 等[5]發(fā)現(xiàn)缺失LMP基因的人類T2淋巴細(xì)胞中，其抗原提呈功能未缺陷, 因此認(rèn)為L(zhǎng)MP基因并不是抗原提呈過(guò)程中的必需基因，考慮可能存在其他類蛋白水解酶。

2 LMP7(β 5i)的免疫功能與自身免疫性疾病

2.1 LMP7(β 5i)的免疫功能

LMP7(β 5i)具有MHC-Ⅰ類分子提呈抗原及促進(jìn)Th淋巴細(xì)胞分化的作用。內(nèi)源性蛋白在胞質(zhì)中泛素化后經(jīng)26S蛋白酶體降解，被水解成長(zhǎng)度為8～10個(gè)氨基酸殘基的短肽鏈。這些短肽鏈末端大多為堿性或疏水性氨基酸，在ER中與MHC-Ⅰ類分子的抗原結(jié)合溝槽結(jié)合，隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，被細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞識(shí)別，從而激活T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞免疫。研究表明，MHC-Ⅰ類分子所提呈的抗原來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)經(jīng)蛋白酶體途徑產(chǎn)生的多肽。IFN-γ誘導(dǎo)可迅速提高LMP2、LMP10和LMP7等蛋白酶體亞單位的表達(dá)，LMP2、LMP10和LMP7被優(yōu)先用于組裝成免疫蛋白酶體，而免疫蛋白酶體比標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性更高。抑制免疫蛋白酶體，一些具有免疫顯性的抗原表位明顯下調(diào)。蛋白酶體抑制劑如乳胞素等可阻斷細(xì)胞的抗原提呈，使得抗原肽生成減少[6]。在淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎(lymphocytic chorimeningtis virus,LCMV)感染時(shí)，LMP7(β5i)基因敲除小鼠MHC抗原表位比野生型減少50%,病毒感染載量和總的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)沒(méi)有顯著性差異[7]。Kalim等[8]發(fā)現(xiàn)，LMP7具有調(diào)控和抑制Th淋巴細(xì)胞分化的作用。敲除或抑制LMP7基因可抑制Th17淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞發(fā)育。同時(shí)LMP7抑制和阻斷Th17細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)磷酸化，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中Smad的磷酸化。LMP7抑制劑可減少STAT1磷酸化和Th1細(xì)胞發(fā)育。LMP7缺乏的雞卵清蛋白誘導(dǎo)或皮下注射所致的急性哮喘小鼠癥狀減輕，同時(shí)支氣管肺泡灌注液中嗜酸性粒細(xì)胞水平降低，雞卵清蛋白特異性IgG減少，而調(diào)節(jié)性和Th1淋巴細(xì)胞不受影響[9]。

2.2 LMP7(β5i)與自身免疫性疾病

LMP7(β5i)基因只有一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的變化，即第2外顯子編碼產(chǎn)生的蛋白145位由Lys轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝滨０?。它不僅有種族、地域分布的差異性，也與眾多的免疫相關(guān)性疾病有關(guān)。于亮等[10]報(bào)道云南地區(qū)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者LMP7基因rs17587位點(diǎn)的GG基因型頻率明顯高于對(duì)照組。近年研究顯示原發(fā)性干燥綜合征患者唇腺組織內(nèi)LMP2、LMP10和LMP7等的mRNA表達(dá)上調(diào)。李珍等[11]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法觀察到原發(fā)性干燥綜合征患者的唇腺中LMP7表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示免疫蛋白酶體與干燥綜合征密切相關(guān)。綜上所述，LMP7(β5i)在自身免疫性疾病的發(fā)病中有著重要作用。一些遺傳性自身免疫性疾病的發(fā)生與LMP7基因的突變亦相關(guān)。研究表明，肌肉萎縮、小紅細(xì)胞性貧血和脂膜炎誘導(dǎo)脂肪代謝障礙綜合征患者的LMP7基因的224位點(diǎn)C突變?yōu)門后[12]，編碼產(chǎn)生的蛋白的第75位Thr即變?yōu)榈鞍彼?，可改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其酶蛋白樣活性降低，影響MHC-Ⅰ類分子抗原提呈過(guò)程。非典型慢性中性粒細(xì)胞白血病、脂肪代謝障礙性皮膚病和高溫綜合征與LMP7基因突變也相關(guān)[13]。

2.2.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 LMP7(β5i)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用已分別在膠原抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen antibody-induced arthritis，CAIA)和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)2種小鼠模型中得到驗(yàn)證。在CAIA模型中，LMP7(β5i)特異性抑制劑PR-957(又稱ONX0914)可阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，且作用方式呈劑量依賴型；在CIA模型中，PR-957同樣也可延緩Ⅱ型CIA。抑制LMP7(β5i)可減少循環(huán)中自身抗體及軟骨降解產(chǎn)物，提取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抑制LMP7(β5i)后白細(xì)胞介素-23合成及TNF-α的分泌明顯減少，提示LMP7(β5i)可同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞活化及炎性因子分泌參與疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]。

2.2.2 炎性腸病 蛋白酶體抑制劑硼替佐米(bortezomib)通過(guò)抑制LMP7(β5i)可抑制大鼠及小鼠[15]的炎性腸病。組織檢測(cè)結(jié)果表明LMP7(β5i)-/-小鼠組織中的中性粒細(xì)胞、Th1、Th17浸潤(rùn)明顯減少，提示LMP7(β5i)主要通過(guò)促進(jìn)上述炎癥細(xì)胞在組織的浸潤(rùn)、分化而介導(dǎo)組織損傷。

2.2.3 橋本氏甲狀腺炎和彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)癥 橋本氏甲狀腺炎和彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)癥是2種甲狀腺的自身免疫性疾病，前者是特異性T淋巴細(xì)胞識(shí)別自身抗原誘導(dǎo)的自身免疫性疾病，涉及Th及Tc；而后者是異常表達(dá)的促甲狀腺激素受體抗體誘導(dǎo)的自身免疫性疾病，涉及Th及B淋巴細(xì)胞。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)抑制LMP7(β5i)可有效緩解疾病的發(fā)生發(fā)展，并證實(shí)小鼠腹腔注射PR-957可緩解甲狀腺炎的發(fā)生并呈劑量依賴性，劑量為2～25 mg/kg。但PR-957對(duì)抗甲狀腺球蛋白自身抗體的劑量依賴卻不顯著，僅在25 mg/kg時(shí)有明顯的抑制作用，稍低于30 mg/kg的致死劑量。25 mg/kg 劑量的PR-957可明顯抑制小鼠甲狀腺炎的評(píng)級(jí)，但對(duì)抗甲狀腺球蛋白抗體卻無(wú)作用，初步證實(shí)25 mg/kg的 PR-957主要通過(guò)抑制蛋白酶體活性而起治療作用。PR-957對(duì)彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進(jìn)癥的作用在小鼠模型中也被驗(yàn)證，結(jié)果表明無(wú)論采用何種方式給予PR-957以抑制LMP7(β5i)，均不影響疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。

2.2.4 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 該病是一種自身免疫系統(tǒng)失調(diào)、伴IFN-α及多種自身抗體產(chǎn)生的復(fù)雜的自身免疫性疾病。在疾病發(fā)生過(guò)程中，蛋白酶體活性被抑制，導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路不能活化，使ER聚集許多折疊異常的蛋白，導(dǎo)致諸多自身抗體產(chǎn)生而誘導(dǎo)系統(tǒng)性自身免疫反應(yīng)。研究表明，對(duì)于狼瘡高風(fēng)險(xiǎn)的小鼠使用PR-957可阻止疾病的發(fā)生，而對(duì)已患狼瘡的小鼠則可阻止疾病的進(jìn)展，緩解腎炎癥狀[17]。進(jìn)一步檢測(cè)表明短期藥物治療后，脾臟及骨髓內(nèi)漿細(xì)胞減少，血清中總IgG和抗雙鏈DNAIgG的水平也有所下降。Ichikawa等[17]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制LMP7(β5i)后可阻斷漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的Toll樣受體活化，從而抑制INF-α的合成。所以，抑制免疫蛋白酶體活性主要通過(guò)抑制IFN活化及自身抗體產(chǎn)生來(lái)延緩系統(tǒng)性紅斑狼瘡的進(jìn)展。

3 LMP7(β5i)與心腦血管疾病

3.1 病理性心肌肥厚

異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚模型中LMP7(β5i)表達(dá)增加，PR-957可減弱異丙腎上腺素注射后心臟體積的增大，減輕異丙腎上腺素引起的小鼠左心室膠原沉積與纖維化。PR-957可抑制NF-κB信號(hào)通路表達(dá)及下游TNF-α和IL-1β表達(dá)，減輕組織的炎癥反應(yīng)，從而減輕病理性心肌肥厚[18]。在醋酸脫氧皮質(zhì)酮(desoxycorticosterone acetate，DOCA)誘導(dǎo)鹽敏感型高血壓小鼠心肌肥厚模型中，皮下植入DOCA藥片組小鼠LMP7(β5i)蛋白水平、心肌肥厚指標(biāo)(心臟重量/體質(zhì)量、心室壁厚度、心肌細(xì)胞面積)及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶蛋白水平相比對(duì)照組均明顯增高，PR-957抑制LMP7(β5i)表達(dá)后，以上指標(biāo)水平明顯降低[19]。

3.2 動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥

腦卒中為常見(jiàn)腦血管動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥，可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重者危及生命。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一過(guò)性阻斷大腦中動(dòng)脈后，同側(cè)缺血腦皮質(zhì)和紋狀體內(nèi)都可檢測(cè)到LMP2(β1i)和LMP7(β5i)高表達(dá)，表達(dá)水平在動(dòng)脈阻斷4 h后開(kāi)始升高，24 h后進(jìn)一步升高，72 h后達(dá)峰，7 d后開(kāi)始下降。特異性敲除LMP2(β1i)及LMP7(β5i)基因，可分別導(dǎo)致半胱天冬氨酸酶及糜蛋白酶活性降低，腦梗死面積縮小[20]。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂可導(dǎo)致心臟等靶器官的急性缺血事件，為心血管疾病預(yù)防的重點(diǎn)。髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白為抗凋亡蛋白，可由巨噬細(xì)胞LMP7基因表達(dá)誘導(dǎo)。敲除LMP7基因后可阻止死亡因子Fas/IFN-γ誘導(dǎo)的Mcl-1降解，但對(duì)p-Bcl-2和p-Bcl-XL卻無(wú)作用，非特異性siRNA不可逆轉(zhuǎn)該過(guò)程。抑制蛋白酶體活性后，Mcl-1、p-Bcl-2和p-Bcl-XL的水平明顯升高。上述結(jié)果提示免疫蛋白酶體可能為連接炎癥與血管壁細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，促進(jìn)粥樣硬化斑塊破裂而導(dǎo)致心肌梗死。特異性阻斷免疫蛋白酶體表達(dá)有望為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的預(yù)防提供新手段。

4 LMP7(β5i)與腫瘤

腫瘤細(xì)胞與LMP基因缺失或下調(diào)正相關(guān)，原因?yàn)闊o(wú)法產(chǎn)生適合與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的短肽，導(dǎo)致MHC-Ⅰ類分子在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)下調(diào)，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞溶解的敏感性，從而逃避免疫監(jiān)視。研究表明LMP7(β5i)在子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和子宮頸癌組織中隨著病變加重而表達(dá)水平降低，呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，并且與腫瘤分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外LMP7(β5i)基因缺失與腫瘤預(yù)后及浸潤(rùn)深度>15 mm相關(guān),具體機(jī)制尚未清楚[21]。LMP7(β5i)不同亞型在蛋白酶體20S形成過(guò)程中的作用不同，非功能性LMP7(β5i)E1亞型的表達(dá)上調(diào)及LMP7(β5i)E2亞型表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致蛋白酶體20S不能形成，從而使腫瘤特異性抗原不被有效產(chǎn)生，這也可能是一個(gè)腫瘤逃避免疫監(jiān)視的新機(jī)制。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌、宮頸癌腫瘤細(xì)胞中均有LMP7(β5i)E1基因的轉(zhuǎn)錄，而正常的成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞中均未檢測(cè)到LMP7(β5i)E1，因此推測(cè)LMP7(β5i)E1亞型可能在腫瘤的發(fā)生中起重要的作用。

5 LMP7(β5i)與肥胖

肥胖可導(dǎo)致胰島素抵抗，引起機(jī)體代謝障礙，導(dǎo)致血糖升高、血脂升高及血壓異常等代謝綜合征，增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究顯示，LMP7(β5i)缺陷可減少高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪聚集進(jìn)而防止肥胖，提高小鼠對(duì)肥胖引起的代謝綜合征的抵抗力。同時(shí)LMP7(β5i)缺陷可降低胰脂肪酶表達(dá)、增加糞便中脂質(zhì)含量，抑制高脂飲食后血清甘油三酯水平的升高，減少脂質(zhì)的吸收。

綜上所述，LMP7(β5i)在諸多病理生理過(guò)程及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，如自身免疫性疾病、腫瘤、心腦血管疾病、肥胖與代謝性疾病等，但LMP7(β5i)是否參與血管疾病的發(fā)病有待進(jìn)一步研究，以便為藥物治療提供理論依據(jù)，從而改善疾病預(yù)后。