丁凱 付蓉

近十幾年來，得益于多種新型藥物的臨床應(yīng)用，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的預(yù)后獲得根本性改善，總生存期（overall survival，OS）和無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）均有所提高［1-3］。MM患者誘導(dǎo)治療后的完全緩解率（complete remission，CR）從10%提高至80%［4-5］。患者治療后能否達(dá)到并保持CR直接影響PFS和OS［6］，然而，由于微小殘留病（minimal residual diseases，MRD）的存在，使部分已獲得CR但MRD持續(xù)陽(yáng)性的MM患者早期復(fù)發(fā)，相比于MRD持續(xù)陰性的患者其PFS和OS明顯縮短［7-9］。因此，MM患者治療后使用敏感度較高的試驗(yàn)方法連續(xù)監(jiān)測(cè)MRD并指導(dǎo)臨床治療十分重要，2016年國(guó)際骨髓瘤工作組（international myeloma working group，IMWG）建議將MRD監(jiān)測(cè)納入新的MM治療療效評(píng)價(jià)系統(tǒng)［10］。其他惡性腫瘤的MRD檢測(cè)方法同樣適用于MM患者，需要滿足以下幾點(diǎn)要求［10］：1）對(duì)于異質(zhì)性較大的MM患者，如寡分泌型、不分泌型和輕鏈型，具有普遍適用性和可操作的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)流程；2）試驗(yàn)方法的敏感度至少達(dá)到10-5，且應(yīng)具有高度準(zhǔn)確性和可重復(fù)性；3）試驗(yàn)方法在多中心臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)；4）試驗(yàn)方法對(duì)于多數(shù)患者具有可行性，檢測(cè)周期不宜過長(zhǎng)，對(duì)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)條件不能要求過于苛刻。目前尚無試驗(yàn)方法能夠滿足上述全部要求，但是達(dá)到敏感度10-5的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）檢測(cè)和幾種分子學(xué)檢測(cè)方法，隨著試驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，有望達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。本文即對(duì)用于MM患者M(jìn)RD檢測(cè)的MFC、等位基因特異性寡核苷酸PCR技術(shù)（allele-specific oligonucleotide-dependent polymerase chain reaction，ASO-dependent PCR）、新一代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）、數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）和外周血檢測(cè)MRD技術(shù)各自的優(yōu)缺點(diǎn)和最新進(jìn)展予以綜述，期待中國(guó)MM患者M(jìn)RD檢測(cè)能普遍應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

1 MFC檢測(cè)MM患者的MRD

MFC在MM患者惡性漿細(xì)胞MRD檢測(cè)的重要性在2008年已被證實(shí)，Paiva等［7］研究對(duì)非透析的MM患者（non-dialysis MM，NDMM）在治療后第100天使用4色直接熒光標(biāo)記漿細(xì)胞，其抗體方案為CD38/CD56/CD19/CD45、CD138/CD28/CD33/CD38和 CD20/CD117/CD138/CD38，結(jié)果在90%患者中檢測(cè)到克隆性漿細(xì)胞，使用MFC檢測(cè)MRD是MM患者PFS和OS最重要的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，MRD每降低1個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，OS約延長(zhǎng)1年，中位PFS（median PFS，mPFS）為（71個(gè)月vs.37 個(gè)月，P＜0.001），中位OS（median OS，mOS）為（NR vs.89個(gè)月，P=0.002）。

2013年，歐洲骨髓瘤聯(lián)盟完成了IX試驗(yàn)［11］，其中部分結(jié)果是在英國(guó)一個(gè)單中心使用6色流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)MM患者M(jìn)RD，抗體方案為CD138、CD45、CD19、CD56和CD27，得出與Paiva等［7］研究相似的結(jié)果。試驗(yàn)檢測(cè)378例接受誘導(dǎo)化療的患者和397例使用大劑量馬法蘭+自體干細(xì)胞移植100天患者的MRD，計(jì)數(shù)50萬個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，以發(fā)現(xiàn)5個(gè)異常漿細(xì)胞為折點(diǎn)，結(jié)果顯示MRD陰性患者和陽(yáng)性患者的PFS及OS分別為（28.6個(gè)月vs.15.5個(gè)月，P＜0.001）和（80.6個(gè)月 vs.59個(gè)月，P=0.018），敏感度為0.01%，提示MFC檢測(cè)MRD對(duì)于MM患者的PFS和OS具有強(qiáng)烈的預(yù)測(cè)性。

在隨后的幾年中，陸續(xù)發(fā)展了8色到10色的流式抗體組合方案。2012年歐洲血液腫瘤試驗(yàn)基金制定了“歐洲兩管8色方案”，兩管分別加入CD45/CD138/CD38/CD56、beta-2微球蛋白/CD19/胞質(zhì) Ig kappa/胞質(zhì) Ig lambda 和 CD45/CD138/CD38/CD28/CD27/CD19/CD117［12］。2014 年，Behdad 等［13］研究使用9色11參數(shù)的流式檢測(cè)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)的比對(duì)，其抗體方案為CD19、CD20、CD38、CD45、CD56、CD117、CD138和胞質(zhì)輕鏈，標(biāo)本要求使用未混血的首份骨髓，EDTA或肝素抗凝，48 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。2016年，有研究報(bào)道71例自體干細(xì)胞移植后患者 5色流式檢測(cè) MRD（CD45、CD138、CD38、CD56、CD19）與血尿蛋白電泳、免疫固定電泳和血清游離輕鏈的比對(duì)結(jié)果，敏感度為0.01%［14］。

為使MFC檢測(cè)MM患者M(jìn)RD標(biāo)準(zhǔn)化，國(guó)際臨床流式委員會(huì)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）于2014年開始協(xié)作，并于2016年最終制定了目前唯一的骨髓瘤患者M(jìn)RD臨床檢測(cè)指南［15-16］，指南建議使用8色方案，其檢測(cè)敏感度為10-5～10-4，檢測(cè)異常漿細(xì)胞的基本單抗包括CD38、CD138、CD45和CD19陰性、出現(xiàn)CD56和胞質(zhì)κ和λ免疫球蛋白輕鏈。與此同時(shí)，異常表達(dá)在MM漿細(xì)胞上的標(biāo)志物還有CD20、CD27、CD28、CD117、CD81和CD200，以及最近幾年發(fā)現(xiàn)的CD54和CD307，其中CD117在正常漿細(xì)胞表達(dá)極少［17-18］。在抗體熒光顏色的選擇上，應(yīng)注意低表達(dá)的標(biāo)志物選用高敏熒光，如CD56、CD138和CD117；反之亦然，如CD38；在初診及化療后隨訪監(jiān)測(cè)MRD時(shí)，應(yīng)使用同樣的抗體方案；因此在初診時(shí)選擇高表達(dá)的抗體，在后期隨訪中，易低估MRD［19］。

新一代FCM具有自動(dòng)識(shí)別和分析異常漿細(xì)胞的功能。2017年，西班牙科學(xué)家發(fā)表了新一代FCM與傳統(tǒng) 8色 FCM（CD45、CD138、CD38、CD56、CD27、CD19、CD117、CD81）的比對(duì)結(jié)果［20］。新的抗體組合包括CD38、CD138、CD45、β2微球蛋白、胞質(zhì)κ和λ。結(jié)果顯示，經(jīng)典FCM檢測(cè)MRD陰性患者有25%新一代FCM檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，較其他75%患者PFS明顯縮短，而且檢測(cè)時(shí)間＜4 h，需要骨髓量平均1.5 mL，敏感度達(dá)到10-6。提示隨著新藥物的發(fā)展，使用單克隆抗體藥物治療的患者，如CD38和CD138單抗，應(yīng)調(diào)整 抗 體 組 合 為 CD54、CD229、CD269、CD319 和VS38c［21］。其中CD229是新確定的漿細(xì)胞表面標(biāo)志物，在MRD檢測(cè)中有望取代CD38和CD138［22］。

在細(xì)胞計(jì)數(shù)方面，檢測(cè)MM患者M(jìn)RD不能＜50萬個(gè)細(xì)胞，建議計(jì)數(shù)≥200萬個(gè)細(xì)胞［17］。新版分析軟件可以在預(yù)置海量臨床數(shù)據(jù)的前提下自動(dòng)生成個(gè)體化的抗體組合方案［18］。

2 ASO-PCR檢測(cè)MM患者的MRD

目前所有檢測(cè)MM患者M(jìn)RD的分子生物學(xué)方法均利用個(gè)體化的腫瘤免疫球蛋白基因重排作為檢測(cè)靶點(diǎn)。其中ASO-PCR又分為多種，包括定性ASOPCR、定性巢式ASO-PCR、定量限制稀釋PCR和實(shí)時(shí)定量ASO-PCR（ASO-RQ-PCR）［23-24］。因 ASO-RQPCR操作簡(jiǎn)單且可定量，使用最為普遍。多項(xiàng)研究表明，以10-5～10-4為折點(diǎn)，使用ASO-RQ-PCR檢測(cè)MM患者M(jìn)RD，能夠較好地預(yù)測(cè)患者預(yù)后，且對(duì)于不同方案誘導(dǎo)化療、鞏固化療和自體及異基因干細(xì)胞移植患者均適用［9，23，25］。

ASO-RQ-PCR檢測(cè)MM患者M(jìn)RD主要分為兩步。第一步是使用定性PCR方法多引物擴(kuò)增檢測(cè)出每例患者特定的惡性漿細(xì)胞克隆性免疫球蛋白基因重排［26］。多種免疫球蛋白基因重排可以作為檢測(cè)靶點(diǎn)，包括IGH全VDJ重排、IGH不全DJ重排、IGK缺失、IGK VJ重排和IGL VJ重排［27］。檢測(cè)出的PCR條帶隨后采用Sanger法測(cè)序，即可得到患者特異性的克隆性漿細(xì)胞互補(bǔ)決定區(qū)3（CDR3）的序列。第二步是使用特異性的ASO引物或探針對(duì)患者CDR3序列進(jìn)行 RQ-PCR 檢測(cè)［28］。

ASO-RQ-PCR目前在歐洲已經(jīng)實(shí)現(xiàn)完全的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，在不同實(shí)驗(yàn)室之間數(shù)據(jù)具有可對(duì)比性，而且敏感度在 10-5以上，實(shí)用性較 NGS更強(qiáng)［10，29］。但是，也存在局限性。首先，目前使用的引物模板庫(kù)是由ALL患者M(jìn)RD檢測(cè)演化而來，處于B淋巴細(xì)胞發(fā)育終末期的漿細(xì)胞，在生發(fā)中心接受抗原刺激后，免疫球蛋白基因重排會(huì)再次發(fā)生體細(xì)胞高突變（somatic hyper mutation，SHM），造成引物模板庫(kù)使用效率大幅降低，對(duì)于ASO-RQ-PCR的兩個(gè)步驟，即突變鑒定和實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增均有較大影響［25，27］。解決該問題需使用患者特異性引物或探針，使成功率提高至90%以上。而且由于骨髓單個(gè)核細(xì)胞中漿細(xì)胞比例較低，可使用CD138+分選的漿細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，也可大幅提高成功率［30］。其次，RQ-PCR往往需要反復(fù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，造成DNA標(biāo)本大量消耗，可以使用質(zhì)粒擴(kuò)增患者特異性的免疫球蛋白重排序列［27］。

3 NGS檢測(cè)MM患者的MRD

NGS是一種高通量測(cè)序方法，利用引物庫(kù)中的多種引物對(duì)標(biāo)本中每個(gè)漿細(xì)胞特異的IgH基因平行測(cè)序，研究其基因多樣性［31］。2009年Dana Farber牽頭的多中心聯(lián)合臨床試驗(yàn)中，使用NGS檢測(cè)246例維持治療前和178例維持治療后的MM患者M(jìn)RD［32］。以10-6為折點(diǎn)，對(duì)于維持治療前患者M(jìn)RD陰性組vs.MRD陽(yáng)性組3年P(guān)FS為83%vs.53%，維持治療后為90%vs.59%，呈顯著性差異。多項(xiàng)試驗(yàn)表明，NGS-MRD陰性患者具有更深層次的緩解，預(yù)后明顯更佳［33］。

相比于ASO-RQ-PCR，NGS有下述幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：1）NGS敏感度達(dá)到10-6，較ASO-RQ-PCR高出一個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)［34］；2）NGS檢測(cè)MM患者的MRD適用性可達(dá)到90%，使用CD138+分選后甚至更高［35-36］；3）NGS可使用一致的引物模板庫(kù)，不同于ASO-RQ-PCR必須使用患者特異性的引物或探針，節(jié)省了時(shí)間和人力［36］；4）NGS可捕捉幾乎所有免疫球蛋白基因重排，因此可以捕捉亞克隆和克隆演變，進(jìn)而監(jiān)測(cè)MM患者達(dá)到深度緩解后的寡克隆骨髓瘤細(xì)胞和寡克隆免疫重建［37］；5）NGS不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少樣本DNA的消耗，且試驗(yàn)周期更短。

盡管優(yōu)點(diǎn)突出，局限性同樣明顯。1）使用NGS檢測(cè)MM患者的MRD目前僅有兩個(gè)商業(yè)平臺(tái)，LymphoSIGHT和ImmunoSEQ其他實(shí)驗(yàn)室并未廣泛開展［33］；2）不同于ASO-RQ-PCR、NGS的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)解讀尚未國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化；3）與ASO-RQ-PCR一樣，NGS實(shí)驗(yàn)同樣受到SHM的干擾；4）仍有NGS檢測(cè)不到的克隆重排?？傊?，NGS檢測(cè)MRD陰性一定提示更深層次的緩解，適用于已達(dá)到CR患者的預(yù)后評(píng)估。

4 dPCR檢測(cè)MM患者的MRD

dPCR首創(chuàng)于20世紀(jì)90年代，由Vogelstein和Kinzler于1999年命名，近幾年開始逐漸應(yīng)用于臨床，目前dPCR已經(jīng)用于檢測(cè)血液惡性腫瘤的MRD［38］。dPCR的基本原理就是將一份標(biāo)本稀釋分割成幾百到幾百萬份，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，每小份標(biāo)本中僅有幾個(gè)目標(biāo)拷貝，然后使用泊松分布的方式分析數(shù)據(jù)，精準(zhǔn)計(jì)算出目標(biāo)拷貝量［39］。目前，兩種商業(yè)化的dPCR設(shè)備可供使用，分別為基于液滴和芯片的dPCR。

根據(jù)目前的研究，dPCR在準(zhǔn)確性和敏感度均與ASO-RQ-PCR相當(dāng)［40］。dPCR是對(duì)目標(biāo)DNA的絕對(duì)計(jì)數(shù)，不需要DNA稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是dPCR尚未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，不同研究的折點(diǎn)數(shù)據(jù)差異較大。2017年，Alikian等［41］對(duì)比了目前3個(gè)dPCR平臺(tái)，Quant Studio 3D（Thermo Fisher）、QX200（Bio-Rad）和Rain Drop（RainD ance），僅 QX200（Bio-Rad）未檢測(cè)出假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，與ASO-RQ-PCR一樣，dPCR前序步驟也需要克隆鑒定、CDR3識(shí)別和ASO引物，因此在適用性和不能檢測(cè)克隆演變方面均會(huì)存在前述同樣的問題。

使用dPCR檢測(cè)MM患者的MRD，目前研究尚少。Drandi等［42］研究18例MM患者，均使用ASORQ-PCR和液滴dPCR（Bio-Rad公司的QX100平臺(tái)）同時(shí)檢測(cè)到IGH克隆重排患者。結(jié)果顯示兩者的檢測(cè)敏感度均達(dá)到10-5；在18例患者的95份標(biāo)本中，二者檢測(cè)的一致性為81%；在不一致的18份標(biāo)本中，有16個(gè)為dPCR陽(yáng)性，但是ASO-RQ-PCR為陰性。目前為止，對(duì)于dPCR檢測(cè)MM患者M(jìn)RD對(duì)預(yù)后的影響尚無研究。

5 外周血檢測(cè)MM患者的MRD

如前所述的MRD檢測(cè)方法均是基于患者的骨髓標(biāo)本，患者需要接受有創(chuàng)的骨髓穿刺檢查。而克隆靶向多肽技術(shù)是以外周血血漿為標(biāo)本，在患者初診鑒定出特異性多肽，然后使用質(zhì)譜分析檢測(cè)MRD的一項(xiàng)技術(shù)［43-44］。該技術(shù)敏感度甚至高于使用骨髓標(biāo)本的其他方法，但與臨床的相關(guān)性尚未驗(yàn)證，且在各實(shí)驗(yàn)室之間難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。其優(yōu)點(diǎn)為有創(chuàng)性降低，但仍需在初診檢測(cè)基線數(shù)據(jù)時(shí)行骨髓穿刺；在瘤負(fù)荷極低時(shí)仍可使用；且規(guī)避了骨髓瘤細(xì)胞髓內(nèi)灶性生長(zhǎng)，骨髓穿刺可能遺漏腫瘤細(xì)胞的缺陷［45］。Korthals等［46］也曾研究使用IgH-qPCR檢測(cè)外周血MRD水平，發(fā)現(xiàn)外周血MRD水平比骨髓MRD水平低40倍，且與血清學(xué)緩解無相關(guān)性，但外周血MRD陰性可改善患者PFS。有關(guān)脂肪活檢及microRNA檢測(cè)MM患者M(jìn)RD的方法尚在研究中，其價(jià)值還未確定［47-48］。

6 結(jié)語(yǔ)及展望

檢測(cè)MM患者M(jìn)RD的終極目標(biāo)為治愈疾病。如何定義MRD，將檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化且普及，將決定患者個(gè)體化治療方案的制定。截至目前，各種方法均存在優(yōu)缺點(diǎn)和局限性，尚無標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，且缺乏大樣本循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)?？傮w而言，目前檢測(cè)MM患者M(jìn)RD的技術(shù)敏感度已達(dá)到10-5，但仍存在普遍適用性和個(gè)體特異性檢測(cè)的矛盾，且對(duì)標(biāo)本質(zhì)量均要求較高。另外，本文綜述的所有方法均無法探查髓外惡性漿細(xì)胞。如實(shí)體腫瘤在內(nèi)的其他腫瘤疾病一樣，MM患者M(jìn)RD的檢測(cè)技術(shù)仍處于發(fā)展階段。綜上所述，連續(xù)監(jiān)測(cè)患者M(jìn)RD，伴隨新藥研發(fā)和多藥聯(lián)合方案的出現(xiàn)不斷調(diào)整治療方法并修正治療指南，將有助于治愈惡性腫瘤。