賀雙意，孔?佳, 2，王媚媚，米立志，秦曉紅, 3

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人、豬和雞源SAMHD1蛋白的酶活性研究

賀雙意1，孔?佳1, 2，王媚媚1，米立志1，秦曉紅1, 3

(1. 天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072；2. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350；3. 南開大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

SAMHD1蛋白是一種天然免疫限制因子，利用其dNTP水解酶活性或核酸酶活性抑制病毒的復(fù)制，具有廣譜抗病毒功能．利用生物信息學(xué)分析該蛋白家族序列保守性，并借助HPLC層析色譜分析與酶活性測(cè)定和酶標(biāo)儀方法，對(duì)人源、豬源和雞源三物種SAMHD1蛋白的酶活性進(jìn)行了比較．比對(duì)發(fā)現(xiàn)SAMHD1蛋白在活性空腔、變構(gòu)位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)等處序列上具有高度的保守性；而且發(fā)現(xiàn)豬源和雞源SAMHD1蛋白同樣具有dNTP水解酶和核酸酶活性；3種蛋白中，人源SAMHD1蛋白dNTP水解酶活性最高，豬源蛋白核酸酶活性最低．這一結(jié)果為研究SAMHD1蛋白家族的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及為畜牧業(yè)優(yōu)良品種的開發(fā)提供啟示．

SAMHD1；物種；蛋白表達(dá)與純化；三磷酸水解酶活性；核酸酶活性

不育a基序和組氨酸/天冬氨酸蛋白1(sterilea-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1，SAMHD1)是一種天然免疫限制因子，廣泛存在于生物體內(nèi)，在抑制病毒感染方面發(fā)揮重要作用．該蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是N末端域、催化核心域和C末端域．其中，催化核心域也稱HD結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)具有三磷酸水解酶(dNTP酶)及核酸酶活性[1-5](見(jiàn)圖1)．SAMHD1蛋白具有廣譜抗病毒功能[6]，其中人源SAMHD1蛋白因具有抗艾滋病病毒活性而成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)．人源SAMHD1蛋白可抑制HIV-1、HBV、HSV-1等多種病毒[7-10]．目前的研究表明，人源SAMHD1主要通過(guò)其dNTP酶與核酸外切酶兩種方式抑制入侵的病毒．在生理?xiàng)l件下SAMHD1以一種無(wú)活性的單體或二體狀態(tài)存在，變構(gòu)劑GTP/ dGTP可以誘導(dǎo)其四聚化，在Mg2+存在的條件下，活化的四聚體水解結(jié)合在其底物空腔的dNTP[11]，降低細(xì)胞內(nèi)dNTP含量，從而抑制病毒的復(fù)制．此外，催化核心域還具有核酸外切酶活性，可以結(jié)合病毒的單鏈核酸(ssDNA/ssRNA)，通過(guò)直接水解入侵病毒的核酸來(lái)抑制病毒[12-13]．雖然人源SAMHD1結(jié)合DNA/RNA的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性，但關(guān)于其核酸外切酶活性的催化與調(diào)節(jié)機(jī)制仍頗有爭(zhēng)議[12-15].在分裂細(xì)胞中，SAMHD1的Thr592磷酸化可以調(diào)節(jié)該蛋白的核酸外切酶活性及其抗病毒功能，但到目前為止，人源SAMHD1蛋白的磷酸化是如何調(diào)節(jié)其活性的具體機(jī)制尚不清楚[16-18]．

圖1人源SAMHD1蛋白催化核心域晶體結(jié)構(gòu)及主要活性位點(diǎn)示意

豬源SAMHD1蛋白已被證明可抑制豬繁殖和呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV，即豬藍(lán)耳病病毒)[7]，該病毒會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的豬傳染病——豬藍(lán)耳病，給包括中國(guó)、美國(guó)等在內(nèi)的諸多國(guó)家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損??失[19-21]．禽類病毒同樣會(huì)給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大損失，禽流感病毒可以通過(guò)突變和跨物種傳播感染人類及其他動(dòng)物．筆者通過(guò)對(duì)SAMHD1蛋白家族進(jìn)行比較分析，推測(cè)雞源SAMHD1可能在禽類中發(fā)揮類似人源SAMHD1的抗病毒功能．

迄今為止，關(guān)于SAMHD1蛋白的研究主要集中在人源蛋白，而對(duì)于其他物種的研究相對(duì)較少，多物種SAMHD1蛋白之間的酶活性差異也鮮見(jiàn)報(bào)道．本研究成功構(gòu)建了人源、豬源和雞源SAMHD1的原核表達(dá)體系，并在體外檢測(cè)了豬源與雞源SAMHD1蛋白的dNTP酶與核酸酶活性．筆者對(duì)這3個(gè)物種SAMHD1蛋白的dNTP水解酶活性以及核酸酶活性進(jìn)行了比較，并對(duì)序列保守性進(jìn)行了分析，結(jié)合已有的人源SAMHD1蛋白三維結(jié)構(gòu)，從分子水平上分析不同SAMHD1酶活性差異的機(jī)制，為畜牧業(yè)相關(guān)的抗病毒研究提供新的思路．

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料和儀器

本實(shí)驗(yàn)室存有編碼人源、豬源和雞源基因的質(zhì)粒，該基因?qū)?yīng)的GeneBank序列號(hào)分別為NM_015474.3、NM_001292105.1和NC_006107.4．上述基因分別克隆至pET28a-Plus(N-6His)載體，目的基因擴(kuò)增及表達(dá)所用菌株XL-10-gold、BL21 (DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存．?dāng)U增目的基因時(shí)所用Trans Start Fast Pfu酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶HI、I與T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自A&B公司；高效液相色譜柱購(gòu)自艾杰爾科技公司；超速離心管購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)珀金埃爾默公司；高壓細(xì)胞破碎儀購(gòu)自廣州聚能生物科技有限公司；蛋白質(zhì)電泳儀購(gòu)自Bio-Rad公司；Ni-NTA親和層析柱、Superdex 200分子篩以及AKTA purifier均購(gòu)自美國(guó)GE公司．

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?構(gòu)建pET28a-Plus(N-6His)-原核表達(dá)質(zhì)粒

人源SAMHD1蛋白由626個(gè)氨基酸組成，而豬源與雞源SAMHD1蛋白分別由627和614個(gè)氨基酸組成(見(jiàn)圖2)，鑒于該蛋白的dNTP酸和核酸酶活性位點(diǎn)皆位于HD結(jié)構(gòu)域，本研究分別以人、豬以及雞源SAMHD1蛋白截短體的基因?yàn)槟０?以下用表示)，用Pfu高保真PCR酶擴(kuò)增目的基因，三物種所用的引物如表1所示，延伸時(shí)間為2,min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)．?dāng)U增結(jié)束后，以PCR產(chǎn)物為底物，加入限制性核酸內(nèi)切酶HI和I，進(jìn)行酶切消化，同時(shí)用相同的限制性內(nèi)切酶消化pET28a-Plus(N-6His)載體，消化反應(yīng)于37,℃進(jìn)行2,h，待反應(yīng)完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，并用T4連接酶將目的基因連接到pET28a-Plus(N-6His)載體中．并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到XL-10-gold感受態(tài)細(xì)胞中，挑取菌落，并提取質(zhì)粒，3種質(zhì)粒pET-均經(jīng)測(cè)序鑒定正確．

圖2 人、豬、雞源SAMHD1蛋白結(jié)構(gòu)域示意

表1 ?三物種基因擴(kuò)增引物序列

Tab.1 Sequences of PCR primers for cloning the three Samhd1c genes

1.2.2?三物種SAMHD1c蛋白的表達(dá)

將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落至含100,μg/mL卡那霉素的5,mL LB培養(yǎng)液中，37,℃ 220,r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，然后將5,mL培養(yǎng)液接種于含卡那霉素的1,L LB培養(yǎng)液中，37,℃ 220,r/min培養(yǎng)至濃度達(dá)到OD600約為1.0時(shí)，降溫至20,℃培養(yǎng)，并加入200,μmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，16,h后收集菌體．

1.2.3?三物種SAMHD1c蛋白的純化

上述菌液經(jīng)4,000,r/min離心15,min后收集菌體，并將菌體重懸于裂解緩沖液(300,mmol/L NaCl，20,mmol/L Tris pH,8.0，5%甘油，10,mmol/L咪唑，1,mmol/L PMSF)，利用高壓細(xì)胞破碎儀破碎菌體，18,000,r/min離心30,min后收集上清液，經(jīng)Ni-NTA親和層析初步純化和Superdex200分子篩層析純化后，利用SDS-PAGE檢測(cè)SAMHD1c蛋白純度，濃縮后速凍蛋白，存于-80,℃冰箱保存．

1.2.4?三物種SAMHD1c蛋白dNTP酶活性分析

以反應(yīng)底物為dGTP為例，分別將純化的人、豬、雞源SAMHD1c蛋白(0.8,μmol/L)與500,μmol/L的dGTP在反應(yīng)緩沖液(20,mmol/L Tris-HCl，pH,8.0，150,mmol/L NaCl，5,mmol/L MgCl2)中混勻，總體系為250,μL．將反應(yīng)體系置于25,℃，待反應(yīng)一定時(shí)間后，用10,mmol/L EDTA終止反應(yīng)．利用0.5,mL截留分子質(zhì)量為104,g/mol的濃縮管在12,000下離心20,min，以分離蛋白與小分子產(chǎn)物．核苷酸水解產(chǎn)物經(jīng)MP-C18高效液相色譜(HPLC)分析，利用緩沖液B(甲醇)以1,mL/min的速度進(jìn)行線性梯度洗脫(在8,min內(nèi)甲醇體積分?jǐn)?shù)由0線性升至35%)，利用樣品在260,nm處的紫外吸收值計(jì)算產(chǎn)物種類及數(shù)量. 在酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)量中，dGTP濃度分別為100,μmol/L、200,μmol/L、400,μmol/L、600,μmol/L與800,μmol/L，反應(yīng)在25,℃中進(jìn)行3,min，其他操作與上述步驟一致．

1.2.5?三物種SAMHD1c蛋白核酸酶活性分析

分別運(yùn)用兩種方法測(cè)定SAMHD1c蛋白核酸酶活性．方法1利用HPLC方法進(jìn)行分析，具體操作與第1.2.4節(jié)中描述一致，其中底物換為單鏈DNA (ATCGC)．方法2利用酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定SAMHD1蛋白的核酸酶活性，底物為5-FAM熒光基因和3-BHQ1淬滅基因修飾的單鏈核酸(ssDNA)，序列為：5-TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA-3．先將底物ssDNA(10,μmol/L)與SAMHD1c蛋白(3,μmol/L)分別溶于反應(yīng)液(50,mmol/L Tris，pH,7.5，5,mmol/L MgCl2，50,mmol/L NaCl)．再將蛋白溶液分裝至384孔板中，每孔25,μL，然后快速向每孔中加入25,μL底物．利用酶標(biāo)儀測(cè)定485,nm光激發(fā)下的528,nm處發(fā)射光的熒光信號(hào)．

1.2.6?三物種SAMHD1蛋白序列比對(duì)

利用ESPript 3.0在線軟件(http：//espript.ibcp.fr/ ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)對(duì)人、豬與雞源的SAMHD1蛋白序列進(jìn)行分析，其中以已經(jīng)解析出結(jié)構(gòu)的人源SAMHD1蛋白(PDB ID：4Q7H)的二級(jí)結(jié)構(gòu)作為參考．3種SAMHD1蛋白分別來(lái)自物種(NM_015474.3)、(NM_001292105.1)和(NC_ 006107.4)．

2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1?三物種SAMHD1蛋白序列比較分析

人源SAMHD1蛋白具有抗HIV-1病毒及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等功能，其抗病毒機(jī)制研究較為廣泛，豬源SAMHD1蛋白也具有相似的抗病毒活性[7,,22-23]．圖3給出了人源、豬源及雞源三物種SAMHD1蛋白序列比對(duì)分析，其中五角星代表變構(gòu)位點(diǎn)1，藍(lán)色圓圈代表變構(gòu)位點(diǎn)2，綠色三角形代表底物結(jié)合位點(diǎn)，紅色箭頭代表核酸結(jié)合位點(diǎn)，黑色箭頭代表磷酸化位點(diǎn).結(jié)果顯示，豬源SAMHD1與人源的SAMHD1的序列一致性為80.5%，而雞源SAMHD1與人源的SAMHD1的序列一致性為60.0%，具有較高的序列同源性．而特別值得注意的是，構(gòu)成SAMHD1變構(gòu)位點(diǎn)的15個(gè)氨基酸中，其中有13個(gè)在3個(gè)物種的蛋白序列上保持完全一致，另外兩個(gè)在3個(gè)物種SAMHD1序列上為性質(zhì)相似的疏水氨基酸，并且構(gòu)成SAMHD1 dNTP底物結(jié)合位點(diǎn)的14個(gè)氨基酸和1個(gè)已知的核酸結(jié)合位點(diǎn)在3個(gè)物種蛋白序列上保持一致．這種序列上的高度保守性暗示3者可能以相同的方式進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)以及底物水解．同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)人、豬與雞源SAMHD1蛋白在其他一些功能位點(diǎn)上同樣具有高度保守性(如SAMHD1蛋白磷酸化位點(diǎn)T592的序列一致性為100%)，暗示了多物種SAMHD1蛋白在磷酸化調(diào)節(jié)其酶活性及抗病毒功能上可能也具有保守性．這些分析不僅令筆者推測(cè)雞源SAMHD1也具有dNTP酶活性和核酸酶活性，并因此具有可能的抗病毒功能．同時(shí)，也令筆者思考對(duì)于SAMHD1這一蛋白，在其活性部位序列高度保守或一致的情況下，其生物學(xué)活性是否由于其他部分序列或結(jié)構(gòu)上的差異而產(chǎn)生不同．接下來(lái)，筆者開展實(shí)驗(yàn)，比較三物種SAMHD1蛋白dNTP酶與核酸酶活性，以期更好地理解不同物種的生物學(xué)功能．

2.2?構(gòu)建Samhd1c基因原核表達(dá)載體

SAMHD1蛋白的SAM結(jié)構(gòu)域可能參與蛋白與核酸的相互作用，而HD結(jié)構(gòu)域則具有dNTP酶及核酸酶活性，且單獨(dú)的HD結(jié)構(gòu)域具有和全酶近似的dNTP酶和核酸酶活性[4-5]．因此，這里分別構(gòu)建了編碼人源SAMHD1(109～626)、豬源SAMHD1(109～627)與雞源SAMHD1(101～614)的原核表達(dá)載體. 實(shí)驗(yàn)中，取5,μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過(guò)與DNA Marker對(duì)比，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(見(jiàn)圖4)，其中編碼人源SAMHD1(109～626)的基因?yàn)?,554,bp，編碼豬源SAMHD1(109～627)的基因?yàn)?,557,bp，編碼雞源SAMHD1(101～614)的基因?yàn)?,542,bp．剩余PCR產(chǎn)物與克隆載體經(jīng)雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，目的基因片段經(jīng)回收純化后，用T4連接酶連接至pET28a-Plus(N-6His)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至XL-10-gold感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒．質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)成功．

2.3?SAMHD1c蛋白的表達(dá)及純化

分別將構(gòu)建成功的pET28a-Plus(N-6His)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌株進(jìn)行培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后收集菌體．將菌體用高壓裂解，經(jīng)Ni-NTA親和層析與Superdex 200分子篩層析兩步純化，然后分別取3種純化的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析(見(jiàn)圖5)．根據(jù)蛋白質(zhì)一級(jí)序列已知，人源6His-SAMHD1(109～626)蛋白大小為60.9,kg/mol，豬源6His-SAMHD1(109～627)蛋白大小為60.8,kg/mol，雞源6His-SAMHD1(101～614)蛋白大小為60.4,kg/mol．通過(guò)SDS-PAGE電泳分離并與已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行分子質(zhì)量對(duì)比可知，所分離純化的三物種SAMHD1c蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)期相符，目的蛋白的純度均大于95%，適于后續(xù)酶活性實(shí)驗(yàn)．

圖4?三物種Samhd1c基因PCR結(jié)果

圖5?人、豬和雞源SAMHD1c蛋白SDS-PAGE結(jié)果

2.4?三物種SAMHD1c蛋白dNTP酶活性分析

SAMHD1蛋白具有dNTP酶活性，通過(guò)GTP/ dGTP分子誘導(dǎo)蛋白發(fā)生變構(gòu)，調(diào)節(jié)其dNTP水解酶活性[24-25]．其中，dGTP分子既可以作為SAMHD1蛋白的變構(gòu)劑，將SAMHD1蛋白誘導(dǎo)為四聚體的酶活狀態(tài)[26-27]，也可以作為酶催化的底物．筆者檢測(cè)了人、豬、雞三物種SAMHD1對(duì)dGTP的水解活性．首先將上述目的蛋白濃縮至2,mg/mL，以500,μmol/L的dGTP為底物，利用HPLC對(duì)SAMHD1c的dNTP酶活性進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖6)．結(jié)果顯示，3種來(lái)源的SAMHD1c蛋白均具有較高的dNTP酶活性，能夠在短時(shí)間內(nèi)將高濃度dGTP分解(見(jiàn)圖6(a)～(c))．人源SAMHD1c蛋白具有相對(duì)較高的dNTP酶活性，豬源SAMHD1c dNTP酶活性略高于雞源蛋白，但活性相差不大(見(jiàn)圖6(d))．

筆者通過(guò)米氏方程的雙倒數(shù)形式來(lái)計(jì)算三物種SAMHD1c的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)．以dNTP酶活性為例，SAMHD1c蛋白在25,℃和0.8,μmol/L的條件下具有較高的酶活力，筆者固定反應(yīng)中的SAMHD1c的質(zhì)量濃度為50,μg/mL，測(cè)試該酶促反應(yīng)在不同底物濃度下的起始速度，借助雙倒數(shù)法得到三物種SAMHD1c蛋白的m值和cat值．m反映了酶與底物分子特異性結(jié)合能力，m值越小，說(shuō)明該酶與dGTP的親和力越大．如表2所示，在三物種中，人源SAMHD1蛋白m最大，豬源蛋白與雞源蛋白m相近．cat反映了SAMHD1c分子對(duì)底物的催化反應(yīng)速率，結(jié)果顯示，人源SAMHD1的cat最高，豬源蛋白和雞源蛋白的cat相近．

表2?三物種SAMHD1c dNTP酶活性動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Tab.2 Kinetic parameters of dNTPase activities of three SAMHD1c proteins

2.5?三物種SAMHD1c蛋白核酸酶活性分析

人源SAMHD1蛋白具有核酸酶活性，可以對(duì)單鏈RNA、DNA及雙鏈RNA、DNA進(jìn)行剪切，該核酸酶活性被認(rèn)為是除dNTP酶活性之外的抗病毒基?礎(chǔ)[12-15]．但這種抗病毒機(jī)制至今不明，為了探究多物種SAMHD1蛋白是否均具有核酸酶活性，這里分別運(yùn)用兩種方法對(duì)其進(jìn)行探究．首先，以單鏈DNA為底物，利用HPLC檢測(cè)SAMHD1c蛋白對(duì)核酸進(jìn)行水解后的產(chǎn)物，見(jiàn)圖7．如圖7所示，人、豬與雞源SAMHD1c蛋白均具有核酸酶活性，可以將單鏈DNA降解．同時(shí)，筆者還利用酶標(biāo)儀對(duì)不同物種SAMHD1c蛋白核酸酶活性進(jìn)行了檢測(cè)．實(shí)驗(yàn)中，底物核酸兩端分別進(jìn)行5’-FAM熒光基因和3’-BHQ1淬滅基因修飾，當(dāng)SAMHD1c蛋白降解核酸底物時(shí)，3’-BHQ1淬滅基團(tuán)與5’-FAM熒光基團(tuán)分離，從而顯現(xiàn)出FAM熒光信號(hào)．與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致，3種SAMHD1c均顯示出核酸酶活性．并且豬源SAMHD1c蛋白的核酸酶活性較低于人源與雞源SAMHD1c(見(jiàn)圖8)．

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3個(gè)物種SAMHD1c蛋白均具有dNTP酶活性及核酸酶活性，但酶活性高低存在明顯差異，豬源SAMHD1c蛋白表現(xiàn)出低核酸酶活性，而人源SAMHD1c蛋白則表現(xiàn)出高dNTP酶活性.

圖8熒光檢測(cè)法測(cè)定三物種SAMHD1c蛋白核酸酶活性

3?討?論

SAMHD1蛋白是一種天然免疫限制因子，由美國(guó)的Hrecka和法國(guó)的Laguette于2011年幾乎同時(shí)鑒定出[28-29]其抗病毒活性，迅速成為國(guó)際艾滋病病毒領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)．大量關(guān)于人源SAMHD1的研究闡明了SAMHD1在細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答和病毒抑制方面的作用[9,,30]．迄今為止，已有關(guān)于SAMHD1蛋白的研究主要集中在人源蛋白上，而關(guān)于豬源、雞源SAMHD1蛋白的研究卻很少．鑒于禽類病毒和豬繁殖和呼吸障礙綜合癥病毒(PRRSV)已經(jīng)給相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的損失[7,,31-32]，且SAMHD1蛋白在抵抗病毒的侵染上起到重要作用，筆者將目光轉(zhuǎn)向豬源、雞源SAMHD1蛋白與人源SAMHD1的共性與差異的研究，希望能更好理解SAMHD1蛋白家族抗病毒機(jī)制，并為轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)．

本研究以人、豬和雞源SAMHD1c蛋白為研究對(duì)象，對(duì)上述三物種SAMHD1蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)SAMHD1蛋白在變構(gòu)位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和核酸結(jié)合等位點(diǎn)處具有很高的保守性．構(gòu)建了三物種SAMHD1c的原核表達(dá)系統(tǒng)，并成功純化出具有酶活性的高純度SAMHD1c蛋白．通過(guò)HPLC、酶標(biāo)儀等檢測(cè)方法分別比較了三物種SAMHD1蛋白的dNTP酶活性和核酸酶活性．首先，dNTP酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示，3種來(lái)源的SAMHD1c蛋白都具有較高的dNTP酶活性，暗示三者皆可以通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)的dNTP水平來(lái)抑制侵入病毒的復(fù)制，且人源SAMHD1c的dNTP酶活性明顯高于其他物種的SAMHD1．其次，利用HPLC和酶標(biāo)儀進(jìn)行核酸酶活性檢測(cè)．結(jié)果顯示，三物種SAMHD1c蛋白都具有核酸酶活性，即均具有降解所入侵病毒核酸的功能．但豬源SAMHD1c蛋白核酸酶活性卻明顯低于其他物種，因3個(gè)物種SAMHD1蛋白在構(gòu)成dNTP酶與核酸酶活性位點(diǎn)的氨基酸序列上具有高度的保守性，所以造成3個(gè)物種SAMHD1蛋白活性差異的原因可能來(lái)源于該蛋白其他不保守氨基酸的化學(xué)性質(zhì)的差別和相應(yīng)蛋白整體或局部三維結(jié)構(gòu)的改變．具體分子機(jī)制的闡明則有賴于后續(xù)相關(guān)蛋白質(zhì)分子三維精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析與分析．

SAMHD1家族蛋白的抗病毒功能依賴于其dNTP酶活性及核酸酶活性已成為業(yè)界共識(shí)．筆者的研究顯示，這3個(gè)物種SAMHD1蛋白均保留了dNTP酶活性與核酸酶活性，因此，SAMHD1在3個(gè)物種中可能以相似的方式抵抗相應(yīng)物種病毒入侵．隨著人源SAMHD1蛋白的抗病毒機(jī)制研究的深入，相關(guān)研究將有助于理解其他物種SAMHD1蛋白的抗病毒機(jī)制．通過(guò)比較物種之間SAMHD1蛋白序列及酶活性的共性與差異，有助于該領(lǐng)域抗病毒機(jī)制的研究與畜牧業(yè)優(yōu)良品種的開發(fā)．

4?結(jié)?語(yǔ)

筆者借助序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人源、豬源和雞源三物種SAMHD1蛋白活性位點(diǎn)在序列上的共性與差異，利用HPLC、熒光檢測(cè)等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)豬源、雞源SAMHD1蛋白同樣具有dNTP酶和核酸酶活性，人源蛋白dNTP酶活性最高，而豬源蛋白核酸酶活性最低．本研究有助于理解SAMHD1的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和該蛋白的抗病毒機(jī)制，為畜牧業(yè)優(yōu)良品種的開發(fā)提供了啟示．

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(責(zé)任編輯：田?軍)

Enzymatic Activities of SAMHD1s from Human，Pig，and Chicken

He Shuangyi1，Kong Jia1, 2，Wang Meimei1，Mi Lizhi1，Qin Xiaohong1, 3

(1. School of Life Science，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；3. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Sterile α-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1(SAMHD1)，an innate immunological factor，can restrict viral replication by using its deoxynucleotide triphosphohydrolase(dNTPase)or nuclease activities，thus having a broad spectrum of antiviral functions. The sequence conservativeness of human，porcine，and chicken SAMHD1s was analyzed by bioinformatics，and their enzymatic activities were compared by using high performance liquid chromatography(HPLC) and a fluorescent-based enzymatic assay. It is found that the allosteric，nucleotide binding，and phosphorylation sites of SAMHD1 were highly conservative in sequence. Although all the SAMHD1s from the three different species had dNTPase and nuclease activities，they did show difference in the measured activities. Among them，human SAMHD1 had the highest dNTPase activity，and the porcine SAMHD1 had the lowest nuclease activity. This study provides information for understanding SAMHD1 structure-activity relationships and the development of new breeds in the livestock industry.

SAMHD1；species；protein expression and purification；dNTPase activity；nuclease activity

10.11784/tdxbz201703051

Q71

A

0493-2137(2018)01-0009-09

2017-03-20；

2017-05-19.

賀雙意（1990—??），男，碩士研究生，shyhebio@163.com.

秦曉紅，qinxiaohong@tju.edu.cn.

2017-06-13.

http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20170613.1052.004.html.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400465)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(15JCQNJC09800)；南開大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(20150629).

the National Natural Science Foundation of China(No.,31400465)，the Natural Science Foundation of Tianjin(No.,15JCQNJC09800)and the State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology(Nankai University)(No.,20150629).