張 英，周 莉，姜春玲*，蔣小娟，肖乾慧，毛永巧

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東 深圳518036;2 .四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都610041)

細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除感染或受損細(xì)胞，維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。但凋亡細(xì)胞內(nèi)含有大量自身抗原與警報素，若未被及時清除，會導(dǎo)致繼發(fā)性壞死，引起組織損傷甚至自身免疫性疾病[1]。巨噬細(xì)胞密切參與凋亡細(xì)胞的清除，其將凋亡細(xì)胞吞噬、移除的過程，稱為胞葬功能(Efferocytosis)[2]。胞葬功能對維持機(jī)體生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等至關(guān)重要[3]。

Nogo-B是一類主要定位于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞膜的跨膜蛋白，其高表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞中，對巨噬細(xì)胞功能具有一定調(diào)節(jié)作用[4]。研究表明Nogo-B 基因缺陷可導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞的遷移、延展能力降低以及肌動蛋白細(xì)胞骨架重組功能障礙[4]。

肌動蛋白細(xì)胞骨架重組是巨噬細(xì)胞完成吞噬的必經(jīng)步驟[5]。Rho/Rac GTPase是介導(dǎo)胞葬功能時肌動蛋白細(xì)胞骨架重組與凋亡細(xì)胞吞入的重要蛋白酶。激活Rac1可促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，完成凋亡細(xì)胞吞入[6]。Schanda等研究發(fā)現(xiàn)，在單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中，Nogo-B與RhoA/Rac1存在共定位關(guān)系[7]，因此二者可能存在功能上相互關(guān)聯(lián)。

基于以上認(rèn)識，本實驗中我們采用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)巨噬細(xì)胞Nogo-B表達(dá)，通過觀察其對凋亡細(xì)胞吞噬指數(shù)及在凋亡細(xì)胞刺激下Rac1 GTPase活性的變化，探討Nogo-B是否對巨噬細(xì)胞的胞葬功能具有調(diào)控作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株及試劑

J774A.1小鼠巨噬細(xì)胞與HL60早幼粒細(xì)胞株(美國伊利諾伊大學(xué)芝加哥分校麻醉與藥理實驗室胡國昌老師惠贈)；胎牛血清(Invitrogen，美國)、 DMEM 培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific,美國)、RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；兔抗小鼠 Nogo-B抗體(Abcam，美國),兔抗小鼠GAPDH抗體 (Cell Signaling Technology，美國)；RhoA/Racl/Cdc42 活性分析試劑盒(Cytoskeleton,美國)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)-FITC(含 PI)雙染凋亡試劑盒(BD Biosciences，美國)；Nogo-B siRNA(Dharmacon，美國)；紅色與綠色熒光CellTracker(Invitrogen，美國)；Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，美國)

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組

J774A.1巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞自然生長狀態(tài)下匯合50%-70%時分別轉(zhuǎn)入不同濃度(10、20、50、100 nM)Nogo-B siRNA，轉(zhuǎn)染48 h以western印跡法檢測轉(zhuǎn)染效果，優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)染濃度。HL60細(xì)胞用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。

分組：將J774A.1巨噬細(xì)胞分為siRNA 陰性對照組(對照組)與Nogo-B siRNA 干擾組。對照組與Nogo-B siRNA組分別取生長狀態(tài)良好的J774A.1巨噬細(xì)胞，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液、計數(shù)，按每孔5×105個細(xì)胞鋪于普通6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后分別使用陰性對照siRNA與Nogo-B siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后檢測巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的胞葬功能以及在凋亡細(xì)胞刺激下巨噬細(xì)胞內(nèi)Rac1 GTPase活性變化。所有實驗于相同條件下重復(fù)3次。

1.3紫外線法誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡

取107個HL60細(xì)胞，離心去上清，以無色、無血清RPMI培養(yǎng)基10 ml重懸。置于短波紫外燈下室溫照射后(波長254 nm,能量100 J/m2)，轉(zhuǎn)移至 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h。使用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒染色后，以FACSCanto流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,美國)鑒定凋亡細(xì)胞比例，其中Annexin V 陽性，PI 陰性為凋亡細(xì)胞，本方法可獲得90%以上細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖1)。

圖1 紫外線法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

1.4體外檢測巨噬細(xì)胞的胞葬功能

實驗前1日，將105/well巨噬細(xì)胞接種于24孔板。吞噬前分別采用5 μM綠色與2 μM紅色熒光celltracker對巨噬細(xì)胞與凋亡細(xì)胞分別染色30 min及15 min，以PBS洗滌一次以去除多余染料，按照5∶1的比例將凋亡細(xì)胞加入已接種巨噬細(xì)胞的24孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱共同孵育2 h，使巨噬細(xì)胞充分吞噬凋亡細(xì)胞后，免疫熒光顯微鏡下觀察，計算巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬指數(shù)(每100個巨噬細(xì)胞所吞噬的凋亡細(xì)胞總數(shù)除以100，取三次計數(shù)的平均值)。

1.5Western印跡檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

接種于6孔板中的J774A.1巨噬細(xì)胞，加入RIPA裂解液，離心取上清液，BCA法測定各組蛋白含量。加入5X上樣緩沖液，100℃水浴變性提取蛋白，并在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，經(jīng)5 %脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入Nogo-B抗體(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶2 000)、4℃過夜，次日使用PBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，再次洗膜。蛋白條帶以O(shè)dyssey Fcimager (LI-COR Biosciences，美國)化學(xué)發(fā)光/熒光檢測數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測并拍照，應(yīng)用ImageJ 軟件分析條帶光密度。

1.6谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-拉下實驗(GST-pulldownassay)檢測Rac1GTPase活性

按照RhoA/Racl/Cdc42 活性分析試劑盒操作說明進(jìn)行。該試劑盒中含有被標(biāo)記Rho GTPase下游效應(yīng)蛋白的瓊脂糖珠，該瓊脂糖珠可特異性結(jié)合處于活性狀態(tài)的Rho GTPase，將其從瓊脂糖珠洗脫下后，通過Western印跡法可檢測活性Rac1 GTPase的含量。以12%SDS-PAGE行Western印跡分析(同前述)。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1Nogo-B對巨噬細(xì)胞胞葬功能的調(diào)控作用

首先采用Nogo-B siRNA(50 nM)轉(zhuǎn)染、下調(diào)J774A.1巨噬細(xì)胞Nogo-B 表達(dá)，以綠色與紅色熒光celltracker對巨噬細(xì)胞與凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后共同孵育、吞噬2 h，免疫熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，Nogo-B下調(diào)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的胞葬功能明顯受損，吞噬指數(shù)由對照組的(48.9±3.5)%顯著降低至(17.8±2.1)%(P<0.01)(圖2)，提示Nogo-B對巨噬細(xì)胞的胞葬功能具有調(diào)控作用。

圖2 下調(diào)Nogo-B表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的胞葬功能 **P<0.01

2．2Nogo-B對巨噬細(xì)胞RaclGTPase活性的影響

為進(jìn)一步明確Nogo-B如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的胞葬功能，我們使用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)巨噬細(xì)胞Nogo-B表達(dá)后，給予凋亡細(xì)胞刺激，分別于刺激5、10及15 min，采集巨噬細(xì)胞提取蛋白，采用pulldown技術(shù)檢測Rac1 GTPase活性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組巨噬細(xì)胞在凋亡細(xì)胞刺激下Rac1 GTPase被逐漸激活，于刺激后的5至15 min其活性呈遞增趨勢；而使用siRNA下調(diào)Nogo-B表達(dá)后的巨噬細(xì)胞，在凋亡細(xì)胞刺激下Rac1活性無顯著變化，即出現(xiàn)Rac1 GTPase激活障礙(圖3)。肌動蛋白細(xì)胞骨架重組是巨噬細(xì)胞完成吞噬的必經(jīng)步驟，而Rac1 GTPase是完成細(xì)胞骨架重組的重要分子，Rac1激活障礙將影響巨噬細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重組并可能導(dǎo)致吞噬功能受損。因此，該結(jié)果提示Nogo-B 可能通過調(diào)控Rac1 GTPase激活途徑影響細(xì)胞骨架重組，進(jìn)而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬功能。

*P<0.05，**P<0.01

3 討論

人體每天有數(shù)以億計的細(xì)胞發(fā)生凋亡。若凋亡細(xì)胞未被及時清除，就會繼發(fā)性壞死，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)損傷性物質(zhì)大量釋放、損傷機(jī)體。而巨噬細(xì)胞可以通過胞葬功能，在損傷性物質(zhì)釋放到周圍組織之前將凋亡細(xì)胞吞噬并安全移除，因此胞葬功能對維持機(jī)體生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等至關(guān)重要[3]。我們的研究發(fā)現(xiàn)， Nogo-B可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的胞葬功能，采用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Nogo-B 表達(dá)后，巨噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的胞葬功能明顯受損；Nogo-B 可能通過Rac1 GTPase激活途徑，影響細(xì)胞骨架重組，發(fā)揮對胞葬功能的調(diào)節(jié)作用。

胞葬功能受機(jī)體嚴(yán)密調(diào)控，胞葬凋亡細(xì)胞的過程包括凋亡細(xì)胞的識別、吞入及消化等多個環(huán)節(jié)[3,8]，對任一環(huán)節(jié)的調(diào)控均可能影響胞葬功能。Nogo-B是一類主要定位于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞膜的跨膜蛋白，其高表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞中。已有研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-B對巨噬細(xì)胞功能具有一定調(diào)節(jié)作用[4]，Nogo-B 基因缺陷可導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞的遷移、延展能力降低以及肌動蛋白細(xì)胞骨架重組功能障礙[4]。而我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Nogo-B對巨噬細(xì)胞的胞葬功能也有調(diào)控作用，下調(diào)Nogo-B后巨噬細(xì)胞的胞葬功能嚴(yán)重受損，對凋亡細(xì)胞的吞噬指數(shù)由對照組的48.9±3.5%顯著降低至17.8±2.1%。

那么網(wǎng)狀蛋白Nogo-B是如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬功能呢？已知胞葬過程中當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞直接或間接被吞噬細(xì)胞識別后，最終導(dǎo)致Rho/Rac GTPase激活[9,10],促進(jìn)纖絲狀肌動蛋白F-actin聚合并由此介導(dǎo)細(xì)胞骨架重組完成吞入及消化。Rac1 作為Rac GTPase的重要成員，是影響細(xì)胞骨架重組的關(guān)鍵分子，Rac1激活后可通過誘導(dǎo)肌動蛋白聚合、F-actin形成介導(dǎo)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組[11-13]。肌動蛋白細(xì)胞骨架重組是巨噬細(xì)胞完成吞噬的必經(jīng)步驟[5]。而現(xiàn)有研究提示，Nogo-B基因缺陷可導(dǎo)致小鼠骨髓單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞F-actin聚合及由此介導(dǎo)的肌動蛋白細(xì)胞骨架重組功能障礙[4]。此外，有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)中，Nogo-B與RhoA/Rac1存在共定位關(guān)系[7]，提示二者可能存在功能上相互關(guān)聯(lián)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，使用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)巨噬細(xì)胞Nogo-B表達(dá)后，Rac1 GTPase的激活過程受到抑制。提示，Nogo-B可能通過調(diào)控Rac1 GTPase的激活途徑以及由此介導(dǎo)的肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，調(diào)控巨噬細(xì)胞的胞葬功能。

綜上所述，網(wǎng)狀蛋白Nogo-B對巨噬細(xì)胞的胞葬功能具有調(diào)控作用，下調(diào)Nogo-B 表達(dá)后巨噬細(xì)胞的胞葬功能明顯受損；Nogo-B 可能通過Rac1 GTPase激活途徑，影響細(xì)胞骨架重組，發(fā)揮對胞葬功能的調(diào)節(jié)作用。

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