張友浦， 王 敏， 羅光華， 張曉膺△

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1心胸外科，2綜合實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 常州 213000)

24-脫氫膽固醇還原酶(3β-hydroxysterol Δ24-reductase,DHCR24)可催化鏈甾醇轉(zhuǎn)化為膽固醇，參與多種脂代謝異常相關(guān)疾病(肝病、心血管疾病和鏈甾醇血癥等)的發(fā)生發(fā)展。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染導(dǎo)致肝臟脂代謝紊亂以及肝臟炎癥，并且可通過增強(qiáng)子誘導(dǎo)DHCR24表達(dá)增多[1-2]。近期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)DHCR24在肝癌細(xì)胞的表面呈特異性表達(dá)，其單克隆抗體可能發(fā)揮靶向治療作用。由于DHCR24受多種調(diào)節(jié)因子調(diào)控，DHCR24表達(dá)的調(diào)控對(duì)HCV感染疾病的發(fā)生、發(fā)展可能發(fā)揮著重要的作用。

1 DHCR24的生物學(xué)特性

1.1DHCR24基因DHCR24基因位點(diǎn)為1p32.3，跨度約46.4 kb，包含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子，編碼序列長(zhǎng)度為1 551個(gè)核苷酸。DHCR24在合成膽固醇的所有細(xì)胞或組織中表達(dá)，其中在膽固醇豐富的器官或組織(如腦與神經(jīng)組織)中表達(dá)最高，另外，DHCR24在一些分泌類固醇激素的細(xì)胞或器官(如腎上腺、睪丸及卵巢)中表達(dá)也很高。DHCR24表達(dá)的廣泛性提示其生理功能的廣泛性和多樣性。

1.2DHCR24蛋白 DHCR24 mRNA包含約1.5 kb的開放閱讀框，編碼516個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約60.1 kD。多項(xiàng)研究[5-6]證實(shí)DHCR24蛋白包含一個(gè)具有10個(gè)氨基酸片段的保守FAD結(jié)合域，這是酶功能所必需的。此外，DHCR24含有p53和Mdm2的保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展和介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的反應(yīng)至關(guān)重要[7]。DHCR24催化鏈甾醇合成膽固醇是Bloch途徑中的最后一步，當(dāng)DHCR24缺失或失去活性時(shí)，鏈甾醇顯著累積。分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能分析研究[8]首次發(fā)現(xiàn)U18666A可通過變構(gòu)調(diào)節(jié)抑制DHCR24活性，進(jìn)而降低膽固醇合成。

1.3DHCR24的細(xì)胞定位 Greeve等[9]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性DHCR24主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，小部分位于高爾基體中，線粒體中無DHCR24分布。另外，Wu等[7]應(yīng)用免疫定位研究發(fā)現(xiàn)DHCR24在基礎(chǔ)條件下定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，氧化或致癌應(yīng)激可誘導(dǎo)DHCR24定位于細(xì)胞核，消除應(yīng)激原后可逆轉(zhuǎn)，然而紫外或電離輻射應(yīng)激對(duì)DHCR24并無誘導(dǎo)作用，這可能是由于應(yīng)激性質(zhì)不同而決定的。Battista等[10]采用免疫熒光及共聚焦實(shí)驗(yàn)法研究表明促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)可誘導(dǎo)大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中的DHCR24穿梭至細(xì)胞核，并且在人前列腺癌細(xì)胞系與原代細(xì)胞中也可觀察到類似結(jié)果[11]，而U18666A可阻斷ACTH誘導(dǎo)大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中DHCR24核移位，但在前列腺癌細(xì)胞中無作用。關(guān)于ACTH誘導(dǎo)DHCR24核定位的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

DHCR24的表達(dá)可通過轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的反饋系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，其中，甾醇、激素、轉(zhuǎn)錄因子及生長(zhǎng)因子等在轉(zhuǎn)錄水平正反饋調(diào)控DHCR24的表達(dá)，然而，翻譯后調(diào)控對(duì)DHCR24表達(dá)發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控作用，主要是通過降解關(guān)鍵限速酶和角鯊烯單加氧酶及抑制甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白激活等方式來實(shí)現(xiàn)的。此外，不同的表觀遺傳學(xué)重塑也可調(diào)節(jié)DHCR24的表達(dá)。

2 DHCR24表達(dá)的調(diào)控

2.1甾醇類 甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)轉(zhuǎn)錄因子是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。Ramos等[12]研究證實(shí)SREBP的活性與DHCR24表達(dá)具有相關(guān)性。 Horton等[13]發(fā)現(xiàn)甾醇水平降低時(shí)，SREBP裂解活化蛋白(SREBP-cleavage activating protein，Scap)可將SREBP遞送至高爾基體導(dǎo)致其N端水解，活化的SREBP進(jìn)入細(xì)胞核后可結(jié)合靶基因中的甾醇反應(yīng)元件(sterol response elements，SREs)進(jìn)而增加細(xì)胞質(zhì)中脂質(zhì)水平[14]。Zerenturk等[15]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DHCR24的近端啟動(dòng)子(-300 /-100)中存在促進(jìn)甾醇調(diào)節(jié)的甾醇反應(yīng)區(qū)：1個(gè)富含GC的含有2個(gè)SREs的區(qū)域以及2個(gè)鄰近的核因子Y輔因子位點(diǎn)。雙重SREs可協(xié)同作用調(diào)節(jié)DHCR24的表達(dá)。此研究從基因水平上證實(shí)SREBP對(duì)DHCR24具有直接調(diào)控的作用。

2.2激素類 (1)性激素：部分學(xué)者推測(cè)[16]DHCR24對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者的保護(hù)作用與雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen-receptor modulators，SERMs)的神經(jīng)保護(hù)作用之間可能存在著一定的協(xié)同作用。Luciani等[16]研究顯示DHCR24編碼區(qū)上游存在半回文結(jié)構(gòu)雌激素反應(yīng)元件(half estrogen resposive elements，half-EREs)，并且17β雌二醇、他莫昔芬、雷洛昔芬和植物雌激素與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合并通過half-EREs上調(diào)DHCR24的表達(dá)，這為雌激素調(diào)控DHCR24提供了直接的證據(jù)。Benvenuti等[17]證實(shí)ERα在雌激素刺激誘導(dǎo)DHCR24表達(dá)中發(fā)揮主要作用。DHCR24基因啟動(dòng)子序列位于距離翻譯起始位點(diǎn)的-383/-112 bp，而half-EREs定位于DHCR24基因啟動(dòng)子上游區(qū)的-5 000/-3 000 bp區(qū)域[18]。此外，DHCR24還具有對(duì)雄激素的應(yīng)答性，雄激素反應(yīng)元件(androgen responsive element，ARE)位于DHCR24啟動(dòng)子上游區(qū)以及half-EREs序列的下游[19]。進(jìn)一步研究[20]表明，雄激素與雌激素受體反應(yīng)元件均位于啟動(dòng)子(-4 384/-2 892)中，雄激素還可通過Scap促進(jìn)SREBP的活化間接調(diào)控DHCR24表達(dá)[21]。(2)ACTH：DHCR24是人腎上腺表達(dá)最豐富的基因之一[22]。多項(xiàng)研究[10, 23]表明，ACTH促進(jìn)大鼠和人的腎上腺中DHCR24的表達(dá)，DHCR24水平與腎上腺腫瘤ACTH受體基因的表達(dá)顯著相關(guān)。此外，毛喉素(一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑)可上調(diào)DHCR24的表達(dá)，進(jìn)一步表明ACTH上調(diào)DHCR24是通過ACTH/cAMP途徑實(shí)現(xiàn)的。還有研究表明，促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)可通過促黃體激素(luteotrophic hormone，LH)的介導(dǎo)，上調(diào)人神經(jīng)元樣細(xì)胞的DHCR24表達(dá)[24]。(3)甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)：有學(xué)者推測(cè)[25]DHCR24可能是腦中TH效應(yīng)的調(diào)節(jié)子， T3可促進(jìn)神經(jīng)元表型的分化，T3和少量T4顯著增加非成熟神經(jīng)元DHCR24的表達(dá),但在成熟神經(jīng)元中，DHCR24表達(dá)顯著降低，且不受TH調(diào)節(jié)。Ishida等[26]研究顯示，TH通過TH受體β(thyroid hormone receptor β，TRβ)于轉(zhuǎn)錄水平增加DHCR24基因表達(dá)，當(dāng)甲狀腺功能不足或TH抵抗時(shí)，肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)可代替TRβ行使功能，以維持DHCR24基因的表達(dá)。TRβ與LXRα競(jìng)爭(zhēng)性地與DHCR24啟動(dòng)子中同一反應(yīng)元件結(jié)合并上調(diào)DHCR24[27]。

2.3肝X受體(liver X receptor，LXR) 研究[28-29]發(fā)現(xiàn)LXR可通過結(jié)合其啟動(dòng)子內(nèi)的LXR反應(yīng)元件誘導(dǎo)參與甾醇流出的基因(如ABC1)表達(dá)，進(jìn)而降低甾醇水平并維持穩(wěn)態(tài)。利用生物芯片技術(shù)研究[30]證實(shí)DHCR24是LXR的靶基因，LXR反應(yīng)元件(liver X receptor response element，LXRE)是位于DHCR24基因第二內(nèi)含子的一個(gè)約1 500 bp的區(qū)域，并且LXR激動(dòng)劑與LXR結(jié)合通過LXRE上調(diào)DHCR24，證實(shí)了LXRE對(duì)LXR的應(yīng)答。人類LXR與TH都需要與類視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異源二聚體并結(jié)合calss direct repeat-4元件才能促進(jìn)DHCR24的表達(dá)[26-27]。

2.4胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors -1，IGF-1) 多種神經(jīng)元表達(dá)IGF-1的受體和ER，雌激素可激活I(lǐng)GF-1受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。由于DHCR24與雌激素介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)，DHCR24可能參與IGF-1的神經(jīng)保護(hù)作用[18, 31]。FNC細(xì)胞表達(dá)IGF-1受體，并且合成和釋放IGF-1、IGFBP2和IGFBP4[31]，其中IGF-1顯著上調(diào)DHCR24。上述結(jié)果提示在雌激素、IGF-1與DHCR24之間可能存在某種聯(lián)系?？傊琁GF-1與17β-雌二醇均可直接刺激DHCR24表達(dá)增多，17β-雌二醇增加IGF-1的釋放。IGF-1以自分泌環(huán)的方式結(jié)合IGF-1受體并通過IGF信號(hào)通路間接上調(diào)DHCR24的表達(dá)。最新研究[32]發(fā)現(xiàn)，胰島素可通過SREBP-2上調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)的DHCR24表達(dá)從而發(fā)揮抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用。而IGF-1與SREBP-2對(duì)DHCR24的作用機(jī)制仍有待研究。

2.5翻譯后調(diào)控 多項(xiàng)研究[33-34]證實(shí)DHCR24在翻譯后受到調(diào)控，主要是通過對(duì)關(guān)鍵限速酶3-羥-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶的降解和抑制。通過降解角鯊烯單加氧酶進(jìn)行通量控制可降低膽固醇的合成[35]。24(S),25-環(huán)氧膽固醇可通過3種途徑降低細(xì)胞膽固醇水平：(1)通過抑制SREBP的激活從而抑制膽固醇合成和攝??；(2)通過刺激3-羥-3-甲戊二酸單酰輔酶A還原酶的降解作用；(3)通過充當(dāng)LXR的潛在配體促進(jìn)膽固醇輸出[36]。高濃度膽固醇不影響DHCR24活性可排除終產(chǎn)物的抑制作用。24(S),25-環(huán)氧膽固醇與鏈甾醇均具有一個(gè)富含電子側(cè)鏈的脂肪族，暗示可能存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。此外，鏈甾醇的異構(gòu)體可抑制DHCR24進(jìn)一步增強(qiáng)不飽和側(cè)鏈的甾醇對(duì)DHCR24的有效抑制作用，具體的分子機(jī)制有待研究。DHCR24具有多個(gè)泛素化位點(diǎn)[37]，其泛素化位點(diǎn)的變化是否調(diào)控DHCR24仍待研究。DHCR24的磷酸化位點(diǎn)(T110、Y299和Y507)的突變導(dǎo)致其酶活性顯著降低[38]。

2.6表觀遺傳學(xué)重塑 多項(xiàng)研究[15, 39]證實(shí)甾醇調(diào)節(jié)區(qū)在DHCR24的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如DHCR24基因的甲基化與組蛋白乙?；捎绊懫浔磉_(dá)。CpG島位于DHCR24基因上游區(qū)-629/+550 bp，其甲基化水平增加可致DHCR24表達(dá)減少；然而，乙?；M蛋白可結(jié)合-1 203/-665 bp之間的增強(qiáng)子進(jìn)而上調(diào)DHCR24。組蛋白脫乙?；敢种苿┒∷徕c處理SH-SY5Y細(xì)胞后，DHCR24水平呈劑量依賴性增加。腎上腺皮質(zhì)癌中DHCR24表達(dá)與其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)也呈負(fù)相關(guān)[40]。近期一項(xiàng)研究[41]分析并評(píng)估了615例嬰兒胎盤中DHCR24基因的表達(dá)，結(jié)果表明DHCR24基因的表觀遺傳修飾與神經(jīng)功能以及生理壓力顯著相關(guān)，強(qiáng)調(diào)了DHCR24基因?qū)τ谏窠?jīng)發(fā)育具有不可忽視的作用。脂質(zhì)表觀基因組關(guān)聯(lián)研究[42]表明高密度脂蛋白膽固醇水平與DHCR24附近的CpG位點(diǎn)的甲基化具有高度相關(guān)性。

2.7外源性化學(xué)物質(zhì) 組成型雄激素受體(constitutive androstane receptor，CAR)與RXR形成異二聚體并結(jié)合calss direct repeat-4元件參與DHCR24調(diào)節(jié)。小鼠CAR的激活可增加血清總膽固醇及肝臟膽固醇生成，部分通過上調(diào)肝臟DHCR24介導(dǎo)，在培養(yǎng)的人肝細(xì)胞中也觀察到CAR通過結(jié)合啟動(dòng)子(-1 593)中的calss direct repeat-4元件上調(diào)DHCR24[43]。孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)與CAR類似，能夠通過結(jié)合相同的元件反式激活DHCR24。孕酮可強(qiáng)烈激活PXR[44]進(jìn)而上調(diào)DHCR24表達(dá)，然而也有研究表明孕酮是DHCR24活性的有效抑制劑[33]。另外，雌激素和雄激素可激活PXR[39]上調(diào)DHCR24。他汀類藥物是CAR和PXR的強(qiáng)活化劑[12]，也可上調(diào)DHCR24表達(dá)[15]，降低總膽固醇。需要更多的研究來解開CAR和PXR對(duì)DHCR24調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。

2.8其它調(diào)節(jié)因素 慢性氧化應(yīng)激可下調(diào)神經(jīng)元DHCR24的表達(dá)[45]，細(xì)菌脂多糖可通過生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和激活p38誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞DHCR24的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)[46]；橙皮素可活化ER，通過ER和酪氨酸激酶受體信號(hào)通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞DHCR24表達(dá)[47]。長(zhǎng)效鈣拮抗藥雙苯吡乙胺可增加大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠同側(cè)丘腦DHCR24的mRNA和蛋白表達(dá)[48]。地塞米松可急劇下調(diào)種馬睪丸中DHCR24表達(dá)[49]。

3 DHCR24與HCV感染的關(guān)系

丙型肝炎病毒感染常常導(dǎo)致肝臟炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化應(yīng)激[1]。最終導(dǎo)致一系列肝臟疾病，包括脂肪變性、脂肪性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等。體內(nèi)外多項(xiàng)研究[50-52]均發(fā)現(xiàn)在HCV感染后DHCR24過表達(dá)，而DHCR24低表達(dá)時(shí)可抑制病毒復(fù)制。然而DHCR24表達(dá)對(duì)于其它肝炎病毒(如HBV)的復(fù)制并不重要，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。HCV感染可能通過增強(qiáng)啟動(dòng)子活性誘導(dǎo)DHCR24表達(dá)。 HCV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活轉(zhuǎn)錄子Sp1促進(jìn)其與DHCR24的結(jié)合并反式激活DHCR24，然而Sp1結(jié)合位點(diǎn)的突變并不參與甾醇調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的激活。在人肝癌細(xì)胞株和HCV陽(yáng)性肝硬化或肝癌患者的研究中[53]發(fā)現(xiàn)，DHCR24啟動(dòng)子中的4個(gè)多態(tài)性與DHCR24表達(dá)增加相關(guān)聯(lián)，表明在HCV感染時(shí)多因素參與DHCR24上調(diào)。HCV感染不影響DHCR24啟動(dòng)子序列的基因多態(tài)性。另一項(xiàng)研究[53]發(fā)現(xiàn)DHCR24啟動(dòng)子中有4個(gè)單核苷酸多態(tài)性與HCV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌和肝硬化有關(guān)。吳瑞珊等[54]研究表明肝臟疾病患者血清中miR-122的表達(dá)水平可作為肝癌早期診斷、手術(shù)療效及預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。筆者認(rèn)為肝臟中DHCR24表達(dá)水平極可能與HCV誘導(dǎo)的肝臟疾病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。

當(dāng)前研究認(rèn)為DHCR24過表達(dá)在HCV相關(guān)肝臟疾病中的作用分為兩方面：一方面，HCV的RNA合成發(fā)生在脂筏膜結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)可保護(hù)病毒復(fù)制的亞細(xì)胞器免受RNA或蛋白降解[55-56]，脂筏形成的破壞可削弱HCV復(fù)制。由于DHCR24是脂筏形成的重要介質(zhì)，這可能是DHCR24促進(jìn)HCV復(fù)制另一種機(jī)制[57-58]。最新研究[59]認(rèn)為DHCR24在HCV誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中持續(xù)表達(dá)，并通過阻斷p53乙?；霸黾悠渑cMdm2癌基因的相互作用抑制p53活性，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的凋亡并增加致瘤性?？傊?，HCV感染的細(xì)胞中DHCR24過表達(dá)通過抗凋亡及促進(jìn)病毒復(fù)制以建立慢性感染，并且可能誘導(dǎo)惡性病變。另一方面，多項(xiàng)研究[51, 60]表明過表達(dá)DHCR24可保護(hù)HCV感染的肝細(xì)胞免受H2O2所致的氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)，DHCR24敲除可增加細(xì)胞對(duì)H2O2的敏感性[61]。研究發(fā)現(xiàn)，DHCR24可抑制caspase-3活化[9]和/或清除ROS[62]，保護(hù)細(xì)胞。還有研究[45]發(fā)現(xiàn)DHCR24過表達(dá)和消除均可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，研究者推測(cè)其中可能存在2種保護(hù)機(jī)制：其一，過表達(dá)DHCR24以膽固醇依賴性的方式抵抗氧化應(yīng)激，并認(rèn)為膽固醇依賴性機(jī)制可能涉及促存活因子(如Akt)的激活；其二，低表達(dá)DHCR24可通過改變p53的狀態(tài)和功能增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，應(yīng)答氧化(和致癌)應(yīng)激時(shí)DHCR24可結(jié)合p53的N端并置換E3泛素連接酶Mdm2，從而導(dǎo)致p53的累積及減少細(xì)胞存活。

近期研究[3]通過檢測(cè)395例HCV陽(yáng)性患者血清中DHCR24自身抗體的含量，發(fā)現(xiàn)DHCR24自身抗體對(duì)肝細(xì)胞癌檢測(cè)的敏感性高于常規(guī)標(biāo)志物甲胎蛋白和異常凝血酶原。應(yīng)用針對(duì)DHCR24的單克隆抗體(2-152a MAb)研究發(fā)現(xiàn)DHCR24在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的表面上特異性表達(dá)，DHCR24可能是HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌治療的有價(jià)值靶標(biāo)，而2-152a MAb似乎對(duì)這種靶向治療有用[4]。

表觀遺傳學(xué)與翻譯后調(diào)控開拓了DHCR24反饋調(diào)控的新方向，然而表觀遺傳學(xué)與翻譯后調(diào)控與疾病的關(guān)系及具體機(jī)制研究較少，對(duì)其深入研究有利于全面了解疾病的發(fā)生發(fā)展、提供新的診斷方法和治療手段。此外，HCV感染誘導(dǎo)肝細(xì)胞DHCR24過表達(dá)，其一方面促進(jìn)膽固醇合成鞏固脂筏、清除ROS保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，另一方面脂筏形成有利于病毒復(fù)制，并且DHCR24抑制p53活性可增加其致瘤性，可能導(dǎo)致惡性病變。筆者認(rèn)為機(jī)體DHCR24水平處于動(dòng)態(tài)平衡，表達(dá)過多或過少均可導(dǎo)致微環(huán)境紊亂，并且在特定環(huán)境、疾病及其進(jìn)程中所需的DHCR24表達(dá)量均不一樣。由于DHCR24在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的表面特異性表達(dá)，DHCR24自身抗體對(duì)肝細(xì)胞癌檢測(cè)的敏感性較高，DHCR24可能是HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌治療的有價(jià)值靶標(biāo)，而2-152a MAb似乎對(duì)這種靶向治療有用。進(jìn)一步研究DHCR24自身抗體、2-152a MAb與HCV的相互作用及其分子機(jī)制有助于為HCV感染疾病提供新的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。