李 婕，祝寒宇，余澤偉，許佩蓉，饒舜禹，金 欣

(紹興文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近年來(lái)全球發(fā)病率迅速升高。一般認(rèn)為PTC是一種惰性腫瘤，具有較高的治愈率和良好的預(yù)后，然而有15%～20%的患者仍然有復(fù)發(fā)或伴有轉(zhuǎn)移的進(jìn)行性疾病過(guò)程[1]?？紤]到疾病預(yù)后的異質(zhì)性，是積極治療腫瘤以預(yù)防疾病復(fù)發(fā)，還是保守治療以減少相關(guān)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，臨床上仍存爭(zhēng)議[2]。問(wèn)題的焦點(diǎn)集中在如何更準(zhǔn)確地識(shí)別最可能具有不良預(yù)后的患者。建立更加精確的風(fēng)險(xiǎn)分層是解決問(wèn)題的關(guān)鍵，進(jìn)一步探明PTC的分子發(fā)病機(jī)制、篩選高效的PTC預(yù)后分子標(biāo)志物是目前研究的重點(diǎn)。

BRAFV600E突變位于人染色體7q34，通過(guò)異常激活促分裂素原活化蛋白激酶 (mitogen-activated pro-teinkinases，MAPK)信號(hào)通路，在包括甲狀腺癌在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。BRAFV600E突變與PTC較差的臨床后果具有較強(qiáng)的相關(guān)性[3]，但尚不能作為PTC患者預(yù)后評(píng)價(jià)的獨(dú)立指標(biāo)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)有利于改善PTC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層，為PTC的治療及預(yù)后判斷提供更為可靠的依據(jù)[5]。本文就BRAFV600E聯(lián)合端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)、微小RNA(microRNA，miRNA)及P53等分子標(biāo)志物檢測(cè)的最新相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 與TERT啟動(dòng)子突變的聯(lián)合檢測(cè)

人體內(nèi)的端粒酶可維持端粒重復(fù)序列長(zhǎng)度，從而拮抗癌細(xì)胞高增殖率誘發(fā)的復(fù)制性衰老和凋亡，其功能異常是許多腫瘤的共同特征。端粒酶活性主要取決于TERT的表達(dá)水平，目前已在甲狀腺癌、黑色素瘤和膀胱癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)兩種常見(jiàn)的TERT啟動(dòng)子突變，分別發(fā)生于-124 bp(chr5：1 295 228 G>A，以下稱為C228T)和-146 bp(chr5：1 295 250 G>A，以下稱為C250T)。在大多數(shù)腫瘤中C228T突變比C250T突變更常見(jiàn)，這兩個(gè)TERT啟動(dòng)子突變以互相排斥的方式發(fā)生，均能產(chǎn)生E-26(ETS)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，增加TERT啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[6]。

甲狀腺癌中的TERT啟動(dòng)子突變常見(jiàn)于侵襲性甲狀腺癌和BRAF突變陽(yáng)性的PTC。與BRAFV600E突變不同，TERT啟動(dòng)子突變與PTC侵襲性臨床病理特征和長(zhǎng)期預(yù)后不良的關(guān)聯(lián)性已非常明確[7]，作為新型預(yù)后標(biāo)志物受到相當(dāng)大的關(guān)注。BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變?cè)赑TC中的聯(lián)合檢測(cè)研究首次報(bào)道于2014年[8]，通過(guò)對(duì)中國(guó)PTC患者的隊(duì)列研究初步驗(yàn)證了兩種突變共存與PTC侵襲性生長(zhǎng)的相關(guān)性，初步揭示了該項(xiàng)應(yīng)用的臨床前景。在對(duì)PTC患者的突變發(fā)生率檢測(cè)中[9]，有11.4%的BRAFV600E突變患者伴TERT啟動(dòng)子突變(中位數(shù)12.9%；范圍4.8%～34.4%)，無(wú)BRAFV600E突變者中TERT啟動(dòng)子突變發(fā)生率為6.3%(中位數(shù)5.4%；范圍0.9%～14.3%)，可見(jiàn)在PTC中兩種突變可能存在密切聯(lián)系。伴雙突變的PTC患者觀察到比伴BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子單獨(dú)突變的PTC患者具有更高風(fēng)險(xiǎn)的臨床病理特征，包括高TNM分期、甲狀腺外侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，表明了其可作為PTC有希望的診斷及預(yù)后遺傳標(biāo)記[6]。通過(guò)臨床1 051例PTC樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子共突變與PTC患者病死率的相關(guān)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出任一單獨(dú)突變或傳統(tǒng)臨床病理特征，證實(shí)了其在PTC侵襲性發(fā)展中的重要作用及兩種突變共存的強(qiáng)大協(xié)同效應(yīng)[10]。由此可見(jiàn)，共存的BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變?cè)赑TC中形成了一種新的遺傳背景，可作為PTC潛在的特殊侵襲性發(fā)病機(jī)制，關(guān)于兩者的聯(lián)合檢測(cè)將可能有助于臨床上PTC的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后評(píng)估。

解釋BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變協(xié)同效應(yīng)的一個(gè)主要的潛在分子機(jī)制是BRAFV600E/ MAP激酶途徑磷酸化并激活FOS，F(xiàn)OS反過(guò)來(lái)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)結(jié)合并激活GABPB啟動(dòng)子，增加GABPB表達(dá)及驅(qū)動(dòng)GABPA-GABPB復(fù)合物的形成，后者選擇性結(jié)合ETS轉(zhuǎn)錄因子，激活突變的TERT啟動(dòng)子最終實(shí)現(xiàn)TERT的過(guò)度表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲行為和腫瘤發(fā)展[11]。除此之外，BRAFV600E/ MAP激酶途徑也可以通過(guò)MYC以TERT啟動(dòng)子突變非依賴性的方式上調(diào)TERT表達(dá)。在黑色素瘤中也觀察到TERT啟動(dòng)子突變與BRAFV600E突變之間存在關(guān)聯(lián)，提示這兩種致癌基因事件之間的協(xié)同效應(yīng)可能是人類腫瘤的普遍現(xiàn)象[12]。由于大多數(shù)研究受限于樣本量及TERT啟動(dòng)子突變的低發(fā)生率，且缺乏有關(guān)TERT啟動(dòng)子突變和BRAFV600E突變狀態(tài)的詳細(xì)數(shù)據(jù)，因此目前仍需要對(duì)大量具有特征性BRAFV600E和TERT啟動(dòng)子突變的PTC患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪的前瞻性隨機(jī)研究，以驗(yàn)證TERT啟動(dòng)子和BRAFV600E突變的協(xié)同作用在評(píng)估PTC患者預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值。

2 與miRNAs表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)

miRNAs是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNAs降解或翻譯阻斷而發(fā)揮基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)功能，其功能異?？纱龠M(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miRNA在PTC中的表達(dá)譜與PTC的組織學(xué)類型和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且與在其他腫瘤中觀察到的現(xiàn)象相反，在PTC中異常表達(dá)的miRNA主要呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，包括miR-146b、miR-221和miR-222等[13]。尤其是近年來(lái)備受關(guān)注的miR-146b，已被證實(shí)其與PTC高風(fēng)險(xiǎn)臨床病理因素特征相關(guān)，具有獨(dú)立的預(yù)后價(jià)值[14]。miRNA在各種人類生物樣本中顯示出良好的穩(wěn)定性，包括細(xì)胞系、新鮮冷凍或經(jīng)石蠟包埋的組織、甲狀腺細(xì)針穿刺活檢(fine-needle aspiration，F(xiàn)NA)組織、血漿、血清和尿液等[15]，因此miRNA作為PTC新興分子標(biāo)志物具有較好的臨床應(yīng)用前景。

將PTC患者分為BRAFV600E突變組和非BRAFV600E突變組，比較miRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在BRAFV600E突變組中，miRNA-221、miR-222和miR-146b表達(dá)水平顯著高于非BRAFV600E突變組，初步提示了BRAFV600E突變與miRNA表達(dá)存在關(guān)聯(lián)[16]。此外，現(xiàn)已觀察到miR-7-5p、miR-204-5p、miR-21*和miR-203的表達(dá)失調(diào)與BRAF陽(yáng)性PTC中的侵襲性行為也存在一定關(guān)聯(lián)(P<0.05)，表明兩者間的相互作用可能是甲狀腺癌變過(guò)程中的關(guān)鍵事件[17-18]。BRAF/miRNA調(diào)控關(guān)系的發(fā)現(xiàn)為PTC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)研究開(kāi)啟了一個(gè)嶄新的視角，BRAF癌基因可通過(guò)改變涉及miRNA生物合成的基因的表達(dá)模式直接或間接影響miRNA表達(dá)[19]，其可能的機(jī)制是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑和AP-1介導(dǎo)了BRAFV600E突變和miRNA異常表達(dá)間的聯(lián)系[18]。另有研究[20]發(fā)現(xiàn)14個(gè)在PTC中表達(dá)下調(diào)最明顯的miRNA中有12個(gè)在BRAFV600E陽(yáng)性PTC樣本中表達(dá)下調(diào)更顯著，且PTC樣本亞型之間miRNA表達(dá)的變化似乎主要與BRAFV600E突變狀態(tài)相關(guān)。對(duì)此進(jìn)行的進(jìn)一步探究表明BRAFV600E突變可組成性激活RAS/RAF/MAPK途徑，從而促進(jìn)miRNA的異常表達(dá)。

也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的miRNA與BRAFV600E突變狀態(tài)無(wú)關(guān)[21]，因此仍需進(jìn)一步闡明miRNA和BRAFV600E突變?cè)赑TC發(fā)生發(fā)展中相互作用的具體機(jī)制。此外，研究之間缺乏一致性是miRNA分析研究的共同缺點(diǎn)，包括實(shí)驗(yàn)方案的變化、測(cè)量平臺(tái)的差異及研究的樣本數(shù)量有限等。由此可見(jiàn)，為了提高miRNA表達(dá)在臨床上的應(yīng)用效率，需深入研究miRNA的生物功能，例如在各種組織中的表達(dá)模式，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證用于檢測(cè)靶miRNA絕對(duì)值的技術(shù)。

3 與P53蛋白表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)

P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)度最高的腫瘤抑制基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物P53可通過(guò)多種途徑調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡。在甲狀腺腫瘤中，P53突變通常發(fā)生在未分化(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)或低分化甲狀腺癌(poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)中(ATC占50%～80%)，然而近來(lái)發(fā)現(xiàn)高達(dá)40%的PTC中也存在P53突變。免疫組化分析顯示P53蛋白表達(dá)穩(wěn)定，其過(guò)表達(dá)已被證實(shí)與PTC的病理分級(jí)、不良預(yù)后相關(guān)，可作為PTC潛在的預(yù)后標(biāo)志物[22]。

致癌性BRAF突變參與PTC的發(fā)生，而腫瘤進(jìn)展及去分化則涉及到包括P53突變?cè)趦?nèi)的其他信號(hào)通路的改變。在BRAFV600E突變誘導(dǎo)的PTC小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)合并BRAFV600E和P53突變可在體內(nèi)協(xié)作以促使其發(fā)展為PDTC和ATC，推測(cè)兩種突變共存或可介導(dǎo)PTC更具侵襲性的行為[23]。BRAF/miR-3151/P53軸的發(fā)現(xiàn)初步提示了其可能的相關(guān)機(jī)制，miR-3151可通過(guò)直接下調(diào)靶P53的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖活躍，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也進(jìn)一步提示了BRAF突變與miRNA表達(dá)之間的聯(lián)系密切性[24]。此外，臨床研究發(fā)現(xiàn)血清P53抗體與BRAFV600E突變的檢測(cè)結(jié)果存在互補(bǔ)性，當(dāng)兩者均為陽(yáng)性時(shí)，與臨床腫瘤指標(biāo)的相關(guān)性顯著提高，對(duì)于PTC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、預(yù)后評(píng)估及治療決策的制定有一定指導(dǎo)意義，如適當(dāng)擴(kuò)大手術(shù)范圍，以減少淋巴結(jié)隱匿癌和術(shù)后意外癌的發(fā)生[25]。由此可見(jiàn)，BRAFV600E突變聯(lián)合P53蛋白異常表達(dá)檢測(cè)具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。

4 問(wèn)題與展望

隨著PTC發(fā)病率全球化的上升，面對(duì)中國(guó)PTC治療不足、規(guī)范和過(guò)度并存的現(xiàn)狀，追求早期精準(zhǔn)診斷及治療的呼聲日益高漲。目前國(guó)內(nèi)PTC分子檢測(cè)的發(fā)展正處于起步階段，BRAFV600E聯(lián)合TERT、miRNAs及P53等分子檢測(cè)的相關(guān)研究已取得一定成果，但不同研究之間樣本來(lái)源及實(shí)驗(yàn)方案的差異導(dǎo)致結(jié)論尚未統(tǒng)一，仍需進(jìn)一步闡明分子聯(lián)合如BRAF/miRNA調(diào)控的具體作用機(jī)制。此外，受限于技術(shù)、設(shè)備及費(fèi)用等因素，實(shí)現(xiàn)多分子聯(lián)合檢測(cè)的臨床普及還存在一定困難。

然而，分子標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)作為新的研究方向有望彌補(bǔ)影像學(xué)檢查、細(xì)針穿刺診斷的不足，輔助PTC復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)精準(zhǔn)分層和預(yù)后評(píng)估，提供靶點(diǎn)治療依據(jù)，從而優(yōu)化PTC患者的個(gè)體化治療，具有巨大的應(yīng)用前景。現(xiàn)關(guān)于TERT啟動(dòng)子突變的聯(lián)合檢測(cè)研究已相對(duì)成熟并初步應(yīng)用于臨床，進(jìn)一步發(fā)掘具有高度特異性和敏感性的miRNAs及深入探究BRAFV600E突變與P53蛋白表達(dá)的相互作用可作為未來(lái)研究的重點(diǎn)。此外，有報(bào)道其他因子如PIK3CA、TgAb等與BRAFV600E突變存在關(guān)聯(lián)，值得后續(xù)進(jìn)一步關(guān)注驗(yàn)證。